含仿生牙周膜的生物牙根支架/细胞/膜片复合体及其组织工程构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种含仿生牙周膜的生物牙根支架/细胞/膜片复合体及其组织工程构建方法。
【背景技术】
[0002]各种原因造成的牙齿缺失一直困扰人类的身心健康，缺失牙齿的修复方法伴随着人类的进步也由简单粗糙变得复杂精细，尽管如此，目前常用的修复方法诸如活动义齿、固定义齿、种植体等都是机械性的修复，存在着各种缺陷，缺乏真正生理意义上的修复，不能满足人类的需要。为此，如何利用人工方法再造出具有生物学活性的牙齿以修复缺牙，实现牙再生(tooth regenerat1n)是目前国内外学者着力研究的热点课题之一。
[0003]从近年牙齿再生研究的发展脉络不难看出，当今口腔再生研究基本遵循如下规律:即从经典的牙齿发育学研究技术发展到胚层重组实验(发育期牙胚组织或细胞的重组体)，期望利用牙齿/牙根/牙周发育的自然规律来实现牙齿/牙根/牙周的再生，或利用成体干细胞和支架材料进行牙再生。目前，牙再生(the whole-tooth regenerat1n)主要包括两种方式:
[0004]1、基于发育学原理牙再生方法:按照发育生物学的基本原理，将牙间充质细胞与牙上皮细胞体外重组培养再植入体内，诱导重组体按照牙齿发育的组织形态学过程再生牙齿；
[0005]2、组织工程学牙再生方法:将种子细胞与预先设计好的具有完整牙形态的生物支架复合，以期形成与正常牙齿外形、结构和功能相似的再生牙。
[0006]然而，上述两种全牙再生方法在发展和应用过程中均遇到瓶颈。对于细胞培养方法而言，同其他器官再生一样，关于牙齿发生发育的机理尚未完全解析，而且啮齿类动物模型得到的牙齿发育信号网络可能很难为人类牙齿再生提供借鉴；对于组织工程学方法而言，全牙再生涉及到了牙冠的再生以及萌出等一系列问题，这些因素均大大阻碍了牙组织工程的研究进程，因此成功仍需时日。
[0007]从解剖学的角度分析，牙根是整个牙齿主要的支持和承重部分，在咀嚼过程中发挥着不可替代的作用。牙根的牙本质具有较高的密度和一定的孔隙结构，成分上约70%为无机矿物，20 %为有机物，10 %为水分，微观结构为无机矿物以的纳米微粒形式有序排列在胶原分子之间与分子表面的矿化胶原结构。牙根再生(root regenerat1n)相对于全牙再生可以避免控制牙齿外形和牙齿萌出的技术难题，而且能解决种植的义齿缺乏生物活性和存在金属异物的缺陷。此外，再生的牙根因具有牙周膜及牙本质结构，还可实现形态及功能的修复，故而在牙齿组织工程研究中具有独特的优势。另外，再生的牙根可以安装人造牙冠，而人造牙冠在外形与功能上都可与天然牙冠相媲美，从而构建出具有完整结构和功能的牙齿。
[0008]要实现以上构想，需要在牙齿缺失部位构建出具有正常牙根生理解剖结构及其功能的生物牙根(b1engineered tooth root ,b1-root)，而实现这一过程则必须满足四个条件:1、合适的支架材料;2、良好的种子细胞;3、可靠的支架/细胞复合体构建方法;4、适宜生物牙根再生的微环境。
[0009]现有技术中对于这种实现生物牙根再生的支架材料来源有两种:动物源性材料(即经过处理加工的同种异体或异种牙根)和人工合成材料。动物源性材料具有免疫原性，临床使用中存在较大的排异、感染风险。人工合成的生物牙根支架材料主要是磷酸钙生物陶瓷材料，如磷酸三钙/羟基磷灰石复合陶瓷等。然而，这种磷酸钙生物陶瓷存在较大不足:
1、磷酸钙生物陶瓷仅为多孔或致密结构的无机陶瓷材料，并不具有牙根的仿生结构和化学组成，不利于生物牙根的重建;2、磷酸钙生物陶瓷脆性较大，不利于术中及术后支架完整性的保持;3、磷酸钙生物陶瓷的降解较慢，不利于在短时间(3?6个月)内重建生物牙根。[00?0]另一方面，在天然牙根的外周、牙槽骨的内侧有一层牙周膜(per1dontium)组织。该牙周膜组织也被称为牙周韧带(per1dontal ligament)，由细胞(成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞、破骨细胞等)、细胞外基质、胶原纤维、神经、血管等组成，具有支持牙齿、感觉、营养和更新牙骨质和牙槽骨等多方面的功能，是生物牙根必不可少的组成部分。因此，生物牙根的构建也应包含牙周膜的构建。有研究表明，通过化学药物刺激体外培养的牙周膜干细胞(per1dontal ligament stem cell，PDLSCs)，可以使细胞分泌大量细胞外基质而形成细胞膜片(cell sheet)，避免了常规的细胞消化过程，从而保留了重要的细胞表面蛋白以及细胞自分泌的外基质(extracellular matrix)，将该细胞膜片包裹在生物牙根支架外部，能够较单纯使用支架材料更有利于生物牙根的构建。然而，在天然牙根周围，牙周膜与牙骨质的结合非常紧密，并具有一定的化学键合，简单地将细胞膜片包裹在支架外部并不能获得与天然牙根和牙周膜类似的紧密结合结构，更无法形成化学键合。
[0011]现有的生物医用材料、支架和组织工程产品尚不能很好地满足上述生物牙根构建的各方面要求。本项发明旨在提供一种具有牙根仿生结构和化学组成、具备合适机械性能和生物降解特性的材料和支架，将材料与细胞混合进行旋转式三位培养以保证其营养供应，并且在支架外部构建一层紧密结合的仿生牙周膜组织，在临床上实现生物牙根的组织学成功构建。
【发明内容】
[0012]针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种含仿生牙周膜的生物牙根支架/细胞/膜片复合体。该生物牙根支架的材料主要为一种无机成分含量较高的矿化胶原，具有与天然牙本质一致的微观结构和化学组成;支架具有与天然牙根近似的宏观外形，内部具有宏观的盲孔或者通孔结构，可用于装载细胞、生长因子、药物等，以及供细胞长入;支架内部复合有牙髓干细胞;外部紧密结合有一层牙周细胞膜片，富含细胞、细胞外基质、胶原纤维等天然牙周膜的主要成分。
[0013]本发明还提供了含仿生牙周膜生物牙根支架材料的制备方法，生物牙根支架/细胞/膜片复合方法，以及生物牙根的组织工程学构建流程。
[0014]本发明的第一方面，提供了一种含仿生牙周膜的生物牙根支架。
[0015]除仿生牙周膜部分，支架的材料为矿化胶原，成分包含胶原和磷灰石，其中磷灰石以弱结晶的纳米微粒形式有序排列在胶原分子之间与分子表面，胶原/磷灰石= 5/5?2/8(w/w);仿生牙周膜为富含细胞、细胞外基质、胶原纤维的牙周膜干细胞细胞膜片，厚度为
0.7mm，由2-3层细胞构成;支架与仿生牙周膜之间具有微观结构镶嵌，并通过细胞外基质形成化学键合。
[0016]所述支架材料中的胶原为动物源性的I型胶原，优选为牛跟腱来源的I型胶原。
[0017]所述支架的材料中磷灰石成分的主要物相为羟基磷灰石。
[0018]所述支架材料还可以含有生物可吸收医用高分子，包括聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)，该生物可吸收医用高分子在支架材料中的含量为不高于50wt%。
[0019]所述支架材料还可以由生物可吸收医用高分子，包括聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)制作成的3维纳米结构支架。
[0020]所述支架在微观上具有一定的孔隙结构，孔隙率为70%?95%，孔径为50?500μm。在宏观上:该支架的外形为柱状体;柱状体的高度为9?12mm;柱状体的外侧面被垂直于柱状体轴向的平面所截得的形状为圆形或者近似圆形，周长为11?14mm;柱状体的上底面为平面或者凸面，若为凸面，凸起高度不高于1_，且该高度计入柱状体的总高度;柱状体的下底面为平面或者凸面，若为凸面，凸起高度不高于1_，且该高度计入柱状体的总高度。
[0021]所述支架内部可以具有沿柱状体轴向方向的通孔，或者开口朝柱状体底面的盲孔，盲孔沿柱状体轴向的长度不小于柱状体高度的2/
文档序号 :
【 9773875 】
技术研发人员：王松灵,胡磊,韩子韵,高振华,王秀梅,裘志烨,王硕,崔福斋
技术所有人：王松灵
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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