一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗的制备方法，具体是一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
全世界目前感染乙型肝炎病毒(HBV)的人有3. 5亿左右，我国目前有慢性HBV感染1. 3亿人。慢性HBV感染严重威胁着人类健康，持续感染会发展为慢性肝炎、肝硬化、肝癌等。目前，医学界尚无根治乙肝的良药，大规模接种乙肝疫苗是预防HBV感染的最经济、 最有效的方法，也是降低HBV危害的根本措施。乙肝疫苗的主要成分是乙肝表面抗原(HbsAg)，佐剂为传统的氢氧化铝。1拟6年Glermy首先发现铝佐剂沉淀的白喉类毒素(DT)悬液要比类毒素本身具有更高的抗原性，自此各种佐剂成为研究的焦点。现有资料表明，新型佐剂乙肝疫苗有脂质 A与铝盐配伍的佐剂系统乙肝疫苗、纳米佐剂乙肝疫苗、脂质体乙肝疫苗、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Gm-CSF)佐剂乙肝疫苗、植物佐剂乙肝疫苗、免疫激活序列佐剂乙肝疫苗、 微球投递佐剂系统乙肝疫苗等(冯利、赵欢、薛士科、齐宪荣“乙型肝炎疫苗及其佐剂的研究进展”。中国新药杂志2007年第16卷第20期)。但新型佐剂乙肝疫苗并未投入产业化的疫苗生产，而只处于研究阶段。对于进行产业化生产还需进一步的考察和验证。迄今为止，铝盐佐剂是唯一被美国食品药品监督局(FDA)批准用于人用疫苗的免疫佐剂，经过长期的应用，氢氧化铝佐剂的有效性和安全性得到了实践的验证。因此，将目前广泛应用的氢氧化铝佐剂进行必要的优化，使其在现有的有效性和安全性基础上得到进一步的优化与提升，对于提高乙肝疫苗的免疫原性是很有必要的。世界卫生组织(WHO)近年统计，在0、1、6个月进行3针乙肝疫苗接种的人群中，约有5%的人是无效的。Gupta等已经证实铝佐剂吸附疫苗的免疫效果取决于佐剂对抗原的吸附度，抗原与佐剂的吸附率是决定免疫效果的重要因素。吸附率越高，免疫效果越好；反之，吸附率越低，免疫效果越差(Gupta Rk, Rost BE, Relyveld Ε, et al. Vaccine design the subunit and adjuvant approach. NEffYork :Plenum Press, 1995 :229-248 ；^Oj开云、当P 全明、“铝佐剂在幽门螺杆菌疫苗中的应用”。免疫学杂志，2004. 20(3) :S50)。WHO要求白喉和破伤风类毒素苗的吸附率至少要达到80%。常规的铝佐剂疫苗分铝沉淀疫苗和铝吸附疫苗两种，铝沉淀疫苗是将铝佐剂悬液加入到抗原中；铝吸附疫苗是将抗原溶液加入到氢氧化铝或磷酸铝佐剂中。现有的乙肝疫苗铝吸附工艺中是先配制Al (OH)3K剂，即AlCl3溶液与NaOH溶液反应生产lmg/ml的 Al (OH) 3再加入乙肝表面抗原，从而制成乙肝疫苗。现有的乙肝疫苗铝佐剂吸附工艺存在佐剂吸附率低、疫苗接种量高和抗体阳转率不理想等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法。现有的乙肝疫苗铝吸附工艺中是先配制Al (OH) 3佐剂，即AlCl3溶液与NaOH溶液反应生产lmg/ml的Al (OH) 3再加入乙肝表面抗原，从而制成乙肝疫苗。其制备工艺如下先用注射用水配制10%々1(13溶液、0. 5mol/L NaOH溶液、0. 9% NaCl溶液；开启搅拌，向反应瓶中按铝佐剂终浓度为1. Omg/ ml的量加入10% AlCl3溶液，再加0. 5mol/L NaOH溶液，当pH值达到7. 0时，停加溶液，补加0. 9% NaCl溶液至所需体积，经12rC，30min湿热灭菌后为待用的铝佐剂；按半成品中抗原终浓度为20μ g/ml的含量量取乙肝表面抗原原液，加入到等体积的铝佐剂中，搅拌充分，即为乙肝疫苗半成品。本发明与现有技术不同的是:A1 (OH)3佐剂不是前期配制完成的，而是将PBS缓冲液、KAl (S04) 2溶液、乙肝表面抗原原液混合后，向混合液中加入NaOH溶液，在线反应生成的 Al (OH)3佐剂，在不断生成Al (OH)3K剂的同时不断包裹和吸附乙肝表面抗原，称之为“原位吸附”。制备的样品为乳白色的凝胶状半固体，它能从溶液中强烈吸附蛋白质抗原，形成沉淀。当其接种到机体内后可形成一个“抗原库”，缓慢释放出抗原，充分延长了抗原的作用时间，起到长期保护的作用。同时还能促进局部(注射部位)巨噬细胞的应答。本发明的技术方案具体为一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法，其特征在于铝佐剂Al (OH) 3是在线反应生成， 即将PBS缓冲液、KAl (S04) 2溶液、乙肝表面抗原原液混合后，向混合液中加入NaOH溶液，在生成Al (OH)3佐剂的同时包裹和吸附乙肝表面抗原，其步骤是①注射用水分别配制3mmol/L PBS缓冲液、质量百分数为10%的KAl (S04) 2溶液、 0. 5mol/L NaOH溶液、质量百分数为0. 9%的NaCl溶液，并用0. 22 μ m的滤膜除菌过滤，备用；②向反应器皿中加入200mlPBS溶液，在搅拌条件下向PBS溶液中加入乙肝表面抗原原液，使其终浓度为20 μ g/ml (按照制备体积600ml，抗原终浓度为20 μ g/ml计算，需要加入抗原12mg)；继续加入150ml PBS溶液，然后加入质量百分数为10%的KAl (S04)2溶液，使其终浓度为0. 5mg/ml (按照制备体积600ml，铝离子终浓度为0. 5mg/ml计算，需要加 Λ KAl (S04) 2溶液54ml)；再加入0. 5mol/LNaOH溶液至pH值为7. 0时，补加质量百分数为 0. 9%的NaCl溶液至600ml，密封混合液，经沉淀洗涤工艺制成乙肝疫苗半成品；所述乙肝表面抗原原液，是按照常规技术制成；步骤②所述沉淀洗涤工艺是i将密封的混合液沉淀12-19小时后，弃掉上清液，留沉淀，加入0. 9% NaCl溶液至半成品原体积，搅拌30分钟，再次密封沉淀；i i重复上述步骤i两次；iii第四次沉淀20小时后取上清液弃掉，加入0. 9% NaCl溶液至半成品原体积， 搅拌30分钟，混勻，制成乙肝疫苗半成品；所述乙肝表面抗原包括重组酵母乙肝表面抗原和重组CHO乙肝表面抗原；所述乙肝表面抗原为重组酵母乙肝表面抗原；所述重组酵母乙肝表面抗原为重组汉逊酵母乙肝表面抗原；所述重组汉逊酵母乙肝表面抗原原液的是由下述制备工艺制成I收集发酵液取国家批准的重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的原始菌种，经四代扩增，制成工作种子批菌种，将其接种于300ml培养基中，30 35°C培养M小时后转接到3L培养基中，30 35°C培养M小时，再转接到30L培养基中30 35°C培养15小时，最终转接到200L培养基中30 35°C培养，控制溶氧大于20%、pH6. 8、空气流量30 200ml/h， 培养65 70小时后，收集表达乙肝疫苗表面抗原的汉逊酵母细胞发酵液；II初步提纯用物理破碎法研磨破碎汉逊酵母细胞发酵液，使其达到90%以上的破碎率；以4000rpm的转速离心去除细胞碎片，用氯化钠/PEG6000进行双水相萃取8_10小时后，于6000rpm的转速离心，留上清液，再用硅胶溶液吸附10-16个小时后，于60°C进行脱吸附反应1小时，再于4000rpm的转速离心，留上清液；III精细纯化将初步提纯样品进行阴离子柱层析，使用lOOmmol/L的Tris缓冲溶液，监测A280nm值，收集OD值大于1的蛋白峰，将蛋白峰用50K膜进行体积浓缩10倍左右，再进行等密度区带离心，监测A280nm值，收集OD值大于1的蛋白峰，之后再用分子筛柱层析，使用生理缓冲溶液进行蛋白分离、脱盐，监测A280nm值，收集OD值大于0. 8的 HBsAg蛋白峰，使其纯度达到99. 0 %以上，最终稀释HBsAg蛋白质含量在100-300 μ g/ml，经 0. 22 μ m的除菌滤膜过滤除菌，即为重组汉逊酵母乙肝表面抗原原液；所述培养基配方为甘油、硫酸镁、氯化钾、氯化钠、磷酸氢铵，每升组分质量比为 5 2 1 0. 1 4，用注射用水配制，经121°C，30min灭菌；所述国家批准的重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的原始菌种的菌种号为 HBsAgU35-16-9 (中华人民共和国药典，2010年版，三部，重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)，第 132页)，由大连汉信生物制药有限公司保存，可通过商业购买的方式从该公司购得。本发明方法制备的乙肝疫苗半成品，按照常规技术加工处理后制成乙肝疫苗成
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ΡΠ O本发明的有益效果为与传统工艺相比，本发明(原位吸附法)所用溶液均经除菌过滤，不必进行高压灭菌，简化工艺步骤且降低生产成本；本发明中的Al (OH)3佐剂为原位反应生成，使乙肝表面抗原吸附率大大提高，从而提高了抗原的免疫原性，疫苗的小鼠ED5tl 检测结果也显著优于前者，能更有效地引起机体产生免疫反应，产生更多的保护性抗体。实践证明用此种方法生产的铝佐剂乙肝疫苗具有接种量小、不良反应少，免疫后可诱导高水平的抗体应答，抗体阳转率高等优点。
具体实施例方式以下通过实施示例与比较示例详细说明本发明，但本发明不受以下实施示例的任何限制。原料说明菌种由大连汉信生物制药有限公司自主研发的以DNA重组技术构建表达HBsAg 的重组汉逊酵母工程菌株，菌种号为HBsAgU35-16-9 (中华人民共和国药典，2010年版，三部，重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)，第132页)，由大连汉信生物制药有限公司保存；发酵培养基配方甘油、硫酸镁、氯化钾、氯化钠、磷酸氢铵，每升组分质量比是 5 2 1 0. 1 4，用注射用水配制，经121°C，30min灭菌；氯化钠溶液浓度3mol/L，使用注射用水配制，经0. 22 μ m的除菌滤膜过滤除菌；PGE6000溶液浓度50%，使用注射用水配制，经121°C，30min灭菌；硅胶溶液浓度7. 5 %，使用注射用水配制，经12rC，30min灭菌；
Tris-HCl+2mol/LNaCl 溶液Tris (批号 WF0131LA01，美国)，浓度 0. lmol/L, pH8. 5，使用注射用水配制，经0. 22 μ m的除菌滤膜过滤除菌；溴化钾溶液密度分别为1. 04g/ml、l. 28g/mlU. Mg/ml，使用注射用水配制，经 0. 22 μ m的除菌滤膜过滤除菌；氯化钠溶液浓度0. 9%，使用注射用水配制，经0. 22 μ m的除菌滤膜过滤除菌；磷酸盐缓冲液磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，浓度3mmol/L，使用注射用水配制，经 0. 22 μ m的除菌滤膜过滤除菌；AlCl3溶液浓度10%，使用注射用水配制；氢氧化钠溶液浓度0. 5mol/L,使用注射用水配制；硫酸钾铝溶液浓度10%，使用注射用水配制，经0. 22 μ m的除菌滤膜过滤除菌。实施例1重组(汉逊酵母)乙肝表面抗原原液的制备发酵取重组汉逊酵母工作种子批菌种1支(由菌种号为HBsAgU35-16_9的重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的原始菌种扩增而得)，接种于300ml培养基中，35°C培养M小时后转接到3L培养基中，35°C培养M小时，再转接到30L培养基中，35°C培养15小时，最终转接到200L培养基中，35°C培养，控制溶氧大于20%、pH6. 8、空气流量30 200ml/h，培养 65小时后，收集表达乙肝病毒表面抗原的汉逊酵母细胞发酵液约M0L。初步提纯用物理破碎法研磨破碎汉逊酵母细胞发酵液，达到92%的破碎率， 以4000rpm的转速离心去除细胞碎片，用氯化钠/PEG6000进行双水相萃取9小时后，于 6000rpm的转速离心，收集上清液约230L，再用硅胶溶液吸附15个小时，于60°C进行脱吸附反应1小时，再于4000rpm的转速离心，收集上清液约110L，完成初步纯化。精细纯化将初步提纯上清液进行DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，上样量为柱体积的10倍，流速为60L/h，用lOOmmol/L的Tris缓冲液洗脱，监测A280nm值，收集OD值大于1的蛋白峰，将收集的蛋白峰进行浓缩，再进行等密度区带离心，监测A280nm值，收集 OD值大于1的蛋白峰，之后再用分子筛柱层析，使用0. 9%氯化钠溶液进行蛋白分离、脱盐， 监测A280nm值，收集OD值大于0. 8的HBsAg蛋白峰共28. 2L。使用HPLC法检测其纯度达到99. 0%以上，最终用磷酸盐缓冲液稀释HBsAg蛋白质含量在220 μ g/ml，经0. 22 μ m的除菌滤膜过滤除菌60L，即为重组汉逊酵母乙肝表面抗原原液。实施例2乙肝疫苗半成品制备(铝佐剂+HBsAg工艺-现有技术)，半成品批号为
5201001铝佐剂制备开启搅拌，向反应瓶中加入10% AlCl3溶液5細1，以50ml/min的速度加入0. 5mol/L NaOH溶液，随时取样测量pH值，当pH值达到7. 00时，停加溶液，加入 0. 5mol/L NaOH 溶液 110ml，再补加 0. 9% NaCl 溶液 436ml 终体积 600ml，再经 121°C，30min 湿热灭菌为待用的铝佐剂。原液稀释取蛋白质含量220μ g/ml的原液(由实施例1制得)54. 5ml放置于 500ml三角瓶中，加入0. 9% NaCl溶液300ml，使其蛋白质含量为40 μ g/ml。半成品吸附开启搅拌，向另一反应瓶中加入300ml铝佐剂，再加入稀释后的原液 300ml，搅拌30min后，即为乙肝疫苗半成品，半成品批号为S201001。实施例3乙肝疫苗半成品制备(铝佐剂+HBsAg工艺-现有技术)，半成品批号为
5201002
铝佐剂制备开启搅拌，向反应瓶中加入10% AlCl3溶液5細1，以50ml/min的速度加入0. 5mol/L NaOH溶液，随时取样测量pH值，当pH值达到6. 95时，停加溶液，加入 0. 5mol/L NaOH 溶液 108ml，再补加 0. 9% NaCl 溶液 438ml 终体积 600ml，再经 121°C，30min 湿热灭菌为待用的铝佐剂。原液稀释取蛋白质含量220μ g/ml的原液(由实施例1制得)54. 5ml放置于 500ml三角瓶中，加入0. 9% NaCl溶液300ml，使其蛋白质含量为40 μ g/ml。半成品吸附开启搅拌，向另一反应瓶中加入300ml铝佐剂，再加入稀释后的原液 300ml，搅拌30min后，即为乙肝疫苗半成品，半成品批号为S201002。实施例4乙肝疫苗半成品制备(铝佐剂+HBsAg工艺-现有技术)，半成品批号为 S201003铝佐剂制备开启搅拌，向反应瓶中加入10% AlCl3溶液5細1，以50ml/min的速度加入0. 5mol/L NaOH溶液，随时取样测量pH值，当pH值达到7. 00时，停加溶液，加入 0. 5mol/L NaOH 溶液 115ml，再补加 0. 9% NaCl 溶液 431ml 终体积 600ml，再经 121°C，30min 湿热灭菌为待用的铝佐剂。原液稀释取蛋白质含量220μ g/ml的原液(由实施例1制得)54. 5ml放置于 500ml三角瓶中，加入0. 9% NaCl溶液300ml，使其蛋白质含量为40 μ g/ml。半成品吸附开启搅拌，向另一反应瓶中加入300ml铝佐剂，再加入稀释后的原液 300ml，搅拌30min后，即为乙肝疫苗半成品，半成品批号为S201003。实施例5乙肝疫苗半成品生产工艺(原位吸附-本发明)，半成品批号为S201004开启搅拌，向反应瓶中，加入200ml PBS溶液；加入220 μ g/ml的原液(由实施例 1制得)54. 5ml ；再加入150ml PBS溶液；再加入10 % KAl (S04)2溶液54. 7ml ；之后加入 0. 9% NaCl溶液至总重量520ml时；开始向反应瓶中以50ml/min速度加入0. 5mol/L NaOH 溶液，当加入45ml的0. 5mol/L NaOH溶液时，取样测pH值，当pH值达到5. 50时，控制流加0. 5mol/L NaOH溶液速度为20ml/min,随时取样测量pH值，当pH值达到7. 00时，停加 0. 5mol/L NaOH溶液，共加入56ml ；最后补加0. 9% NaCl溶液至600ml，搅拌10分钟后停止搅拌；密封沉淀。第一次洗涤沉淀沉淀19小时后，将上清液弃掉，再加入0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml，搅拌10分钟，关闭搅拌，密封沉淀。第二次洗涤沉淀沉淀12小时后，将上清液弃掉，加入0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml，开启搅拌10分钟，关闭搅拌，密封沉淀。 第三次洗涤沉淀沉淀12小时后，将上清液弃掉，补加0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml。 开启搅拌10分钟后，关闭搅拌，密封沉淀。半成品配制沉淀20小时后将上清液弃掉，补加 0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml，开启搅拌30分钟，混勻，即成乙肝疫苗半成品，半成品批号为 S201004。实施例6乙肝疫苗半成品生产工艺(原位吸附-本发明)，半成品批号为S201005开启搅拌，向反应瓶中，加入200ml PBS溶液；加入220 μ g/ml的原液(由实施例1 制得)54. 5ml ；再加入150ml PBS溶液；再加入10% KAl (S04)2溶液Μ. 7ml ；之后加入0.9% NaCl溶液至总重量520ml时；开始向反应瓶中以50ml/min速度加入0. 5mol/L NaOH溶液， 当加入45ml的0. 5mol/L NaOH溶液时，取样测pH值，当pH值达到5. 5时，控制流加0. 5mol/L NaOH溶液速度为20ml/min，随时取样测量pH值，当pH值达到6. 88时，停加0. 5mol/L NaOH溶液，加入52ml ；最后补加0. 9% NaCl溶液至600ml，搅拌10分钟后停止搅拌；密封沉淀。第一次洗涤沉淀沉淀19小时后，将上清液弃掉，再加入0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml，搅拌10分钟，关闭搅拌，密封沉淀。第二次洗涤沉淀沉淀12小时后，将上清液弃掉，加入0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml，开启搅拌10分钟，关闭搅拌，密封沉淀。第三次洗涤沉淀沉淀12小时后，抽取上清液弃掉，补加0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml。 开启搅拌10分钟后，关闭搅拌，密封沉淀。半成品配制沉淀20小时后将上清液弃掉，补加 0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml，开启搅拌30分钟，混勻，即成乙肝疫苗半成品，半成品批号为 S201005。实施例7乙肝疫苗半成品生产工艺(原位吸附-本发明)，半成品批号为S201006开启搅拌，向反应瓶中，加入200ml PBS溶液；加入220μ g/ml的原液(由实施例1 制得)54. 5ml ；再加入150ml PBS溶液；再加入10% KAl (S04)2溶液Μ. 7ml ；之后加入0.9% NaCl溶液至总重量520ml时；开始向反应瓶中以50ml/min速度加入0. 5mol/L NaOH溶液， 当加入45ml的0. 5mol/L NaOH溶液时，取样测pH值，当pH值达到5. 5时，控制流加0. 5mol/L NaOH溶液速度为20ml/min，随时取样测量pH值，当pH值达到6. 92时，停加0. 5mol/L NaOH 溶液，加入58ml ；最后补加0. 9% NaCl溶液至600ml，搅拌10分钟后停止搅拌；密封沉淀。第一次洗涤沉淀沉淀19小时后，将上清液弃掉，再加入0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml，搅拌10分钟，关闭搅拌，密封沉淀。第二次洗涤沉淀沉淀12小时后，将上清液弃掉，加入0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml，开启搅拌10分钟，关闭搅拌，密封沉淀。 第三次洗涤沉淀沉淀12小时后，将上清液弃掉，补加0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml。 开启搅拌10分钟后，关闭搅拌，密封沉淀。半成品配制沉淀20小时后将上清液弃掉，补加 0. 9% NaCl溶液进反应瓶至600ml，开启搅拌30分钟，混勻，即成乙肝疫苗半成品，半成品批号为 S201006。实施例8乙肝疫苗半成品吸附完全性、小鼠ED5tl、铝颗粒沉降速度及外观检测吸附完全性试验方法试剂参考品重组(酵母)乙型肝炎疫苗冻干参考品来源于中国药品生物制品检定所。乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒来源于上海科华生物技术有限公司。试验步骤将待检样品于6500转/分转速离心5分钟取得上清液，依重组乙型肝炎疫苗(酵母)体外相对效力检查法测定参考品、待检样品及其上清液中HBsiVg含量。以参考品HBsAg 含量的对数为横坐标，以其对应吸光度值的对数为纵坐标进行直线回归，相关系数应不低于0.99。将待检样品及上清液的的吸光度值代入直线回归方程，计算HBsiVg含量。再按下式计算吸附率。P(%) = (I--^)XlOO
C/式中P为待检样品的吸附率，％ ；Cs为待检样品上清液的HBsAg的含量，μ g/ml ；Ct为待检样品的HBsAg的含量，μ g/ml。小鼠体内效力(ED5tl)检测方法
试剂乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒来源于上海科华生物技术有限公司。实验动物购于大连医科大学BALB/c小鼠。试验步骤将疫苗连续稀释，每个稀释度接种体重为14 16g的BALB/c小鼠10只，每只腹腔注射1.0ml。饲养4 6周后，从小鼠眼球处取血约lml，制备免疫血清。使用乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒测定抗-HBs，根据每个稀释度的抗体阳性数，计算抗体阳转率，进一步计算ED5tl。ED50值=10舰阳转轉点对数其中50%阳转率终点对数=高于50%阳转率稀释度(含量)对数+距离比X稀
释系列对数
权利要求
1.一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法，其特征在于铝佐剂Al (OH)3是在线反应生成，即将PBS缓冲液、KAl (S04) 2溶液、乙肝表面抗原原液混合后，向混合液中加入NaOH溶液，在生成Al (OH)3佐剂的同时包裹和吸附乙肝表面抗原，包括如下步骤①用注射用水分别配制3mmol/LPBS缓冲液、质量百分数为10 %的KAl (S04) 2溶液、 0. 5mol/L NaOH溶液、质量百分数为0. 9%的NaCl溶液，并用0. 22 μ m的滤膜除菌过滤，备用；②向反应器皿中加入200mlPBS溶液，在搅拌条件下，按半成品中抗原终浓度为 20 μ g/ml的含量，向PBS溶液中加入乙肝表面抗原原液；再加入150ml PBS溶液，按半成品中终浓度为0. 5mg/ml的铝含量加入质量百分数为10%的KAl (S04)2溶液，再加入0. 5mol/ L NaOH溶液，调pH值至7. 0，补加质量百分数为0. 9%的NaCl溶液至600ml，密封混合液， 经沉淀洗涤工艺制成乙肝疫苗半成品。
2.根据权利要求1所述的一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法，其特征在于步骤②所述沉淀洗涤工艺是i将密封的混合液沉淀12-19小时后，弃掉上清液，留沉淀，加入质量百分数为0. 9%的 NaCl溶液至半成品原体积，搅拌30分钟，再次密封沉淀；ii重复上述步骤i两次；iii第四次沉淀20小时后将上清液弃掉，加入质量百分数为0. 9%的NaCl溶液至半成品原体积，搅拌30分钟，混勻，制成乙肝疫苗半成品。
3.根据权利要求1所述的一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法，其特征在于所述乙肝表面抗原包括重组酵母乙肝表面抗原和重组CHO乙肝表面抗原。
4.根据权利要求3所述的一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法，其特征在于所述乙肝表面抗原为重组酵母乙肝表面抗原。
5.根据权利要求4所述的一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法，其特征在于所述重组酵母乙肝表面抗原为重组汉逊酵母乙肝表面抗原。
6.根据权利要求5所述的一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法，其特征在于所述重组汉逊酵母乙肝表面抗原原液的是由下述制备工艺制成I收集发酵液取国家批准的重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的原始菌种，经四代扩增，制成工作种子批菌种，将其接种于300ml培养基中，30 35°C培养M小时后转接到3L培养基中，30 35°C培养M小时，再转接到30L培养基中30 35°C培养15小时，最终转接到 200L培养基中30 35°C培养，控制溶氧大于20%、pH6. 8、空气流量30 200ml/h，培养 65 70小时后，收集表达乙肝病毒表面抗原的汉逊酵母细胞发酵液；II初步提纯用物理破碎法研磨破碎汉逊酵母细胞发酵液，使其达到90%以上的破碎率；以4000rpm的转速离心去除细胞碎片，用氯化钠/PEG6000进行双水相萃取8_10小时后，于6000rpm的转速离心，留上清液，再用硅胶溶液吸附10-16个小时后，于60°C进行脱吸附反应1小时，再于4000rpm的转速离心，留上清液；III精细纯化将初步提纯样品进行阴离子柱层析，使用lOOmmol/L的Tris缓冲溶液， 监测A280nm值，收集OD值大于1的蛋白峰，将蛋白峰用50K膜进行体积浓缩10倍，再进行等密度区带离心，监测A280nm值，收集OD值大于1的蛋白峰，之后再用分子筛柱层析，使用生理缓冲溶液进行蛋白分离、脱盐，监测A280nm值，收集OD值大于0. 8的HBsAg蛋白峰，使其纯度达到99. 0%以上，最终稀释HBsAg蛋白质含量在100-300 μ g/ml，经0. 22 μ m的除菌滤膜过滤除菌，即为重组汉逊酵母乙肝表面抗原原液；所述培养基配方为甘油、硫酸镁、氯化钾、氯化钠、磷酸氢铵，每升组分质量比为 5 2 1 0. 1 4，用注射用水配制，经121°C，30min灭菌。
7.根据权利要求6所述的一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法，其特征在于所述国家批准的重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的原始菌种的菌种号为HBsAgU35-16-9。
全文摘要
本发明公开了一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法，属于生物技术领域。其特征在于铝佐剂Al(OH)3是在线反应生成，即将PBS缓冲液、KAl(SO4)2溶液、乙肝表面抗原原液混合后，向混合液中加入NaOH溶液，在不断生成Al(OH)3佐剂的同时不断包裹和吸附乙肝表面抗原，称之为“原位吸附”。本发明中的Al(OH)3佐剂为原位反应生成，使乙肝表面抗原吸附率大大提高，从而提高了抗原的免疫原性，能更有效地引起机体产生免疫反应，产生更多的保护性抗体。实践证明用本发明方法生产的铝佐剂乙肝疫苗具有接种量小、不良反应少，免疫后可诱导高水平的抗体应答，抗体阳转率高等优点。同时还简化了工艺步骤、大大降低了生产成本。
文档编号A61P1/16GK102198270SQ201110126060
公开日2011年9月28日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者张娟, 张平, 张海春, 李晓宇, 李贵兴, 陈新亭 申请人:大连汉信生物制药有限公司
文档序号 :
【 1010711 】
技术研发人员：李贵兴,张平,张海春,陈新亭,李晓宇,张娟
技术所有人：大连汉信生物制药有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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