一种细菌传递的双交叉保护疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种细菌传递的迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的交叉保护疫苗。
背景技术：
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)分别为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，二者皆为重要的养殖鱼类病原菌，其宿主范围涵盖多种海水和淡水鱼类，包括牙鲆、大菱鲆、罗非鱼、美国红鱼等。在我国，由迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌引起的疫病暴发流行给多种养殖鱼类产业造成了严重的经济损失。除了鱼类夕卜，迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌皆为动物感染性病原，能够感染人类和其它陆生动物。目前，分别针对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的单一性疫苗在国际上已多有报道，但是尚无 能够同时针对这两种病原的交叉保护疫苗。
发明内容
本发明目的在于提供一种细菌传递的交叉保护疫苗。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种交叉保护疫苗，交叉保护疫苗为质粒PDKSlO转化大肠杆菌DH5 α获得的重组菌株。交叉保护疫苗的应用，所述疫苗在制备具有预防和治疗迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的交叉疫苗制剂中的应用。将所述质粒PDKSlO转化入大肠杆菌DH5 α得重组菌株经LB培养基培养至OD6tltl为O. 8-1后溶于PBS。本发明具有如下优点I.制备简单。本发明的疫苗只需简单的常规细菌培养，无需任何提取、纯化过程。2.交叉保护效应。本发明疫苗能够同时保护鱼类抵抗迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌感染，且保护效应分别高达83%和75%。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。实施例II)质粒PEADnaK的构建以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F1/R1为引物进行PCR 扩增，PCR 条件为94°C 60s 预变性模板 DNA，然后 94°C 40s，51。。60s, 72°C 60s，5 个循环后改为94°C 40s，61°C 60s, 72°C 60s，25个循环后再在72°C延伸反应lOmin。PCR产物用“天根生化科技(北京)有限公司"DNA产物纯化试剂盒纯化后与载体pEASY-E2(购自于“北 京全式金生物技术有限公司”)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5ci后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)的LB固体培养基上培养18小时，挑取一个转化子，提取质粒，即为pEADnaK。所述LB组成成分按重量百分比计I. O %蛋白胨，O. 5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5%蒸馏水；所述菌株TXl保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda),保藏时间2008年I月9日。所述弓丨物为Fl :5’ -CCCGGGATGGGTAAAATCATTGGTATCGA-3’和 Rl :5’ -CCCGGGTTTTTTATCTTTCACTTCTTCGAA-3’。2)质粒pDKSlO的构建以海豚链球菌G26为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s, 49°C 60s, 72°C 60s，5个循环后改为94°C 40s, 61 °C 60s, 72°C 60s, 25个循环后再在72°C延伸反应lOmin。PCR产物用天根
DNA产物纯化试剂盒纯化。同时将质粒pBT3用Ndel/EcoRV酶切回收3. 4kb片段。所述质粒pBT3构建过程参见 Zhang ffff, Sun K, Cheng S, Sun L. Characterization of DegQvh, a serine proteaseand a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain. Appl EnvironMicrobiol 2008 ；74 :6254_62。将上述回收片段和纯化的PCR产物用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含安卡青霉素(Ap，50ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBTSialO。将质粒pBTSialO和上述实施例的质粒pEADnaK分别用EcoRV和SmaI酶切，回收4kb和I. 9kb片段，将其用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含Ap (50ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒PDKS10。所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 1984，分类命名为海豚链球菌(Sti^ptococcus iniae)，保藏时间2007年3月22日。所述弓丨物为F2 :5’ -CCCGGGATGGGTAAAATCATTGGTATCGA-3’和 R2 :5’ -GATATCTCCTCCGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’。实施例2疫苗的构建将质粒pDKSlO 按照 Hanahan 方法(Sambrook and Russell Molecular Cloning A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)转化入大肠杆菌DH5，得菌株DH5a /pDKSlO JfDH5 a /pDKSlO 在含 Ap (50ug/ml)的 LB培养基上培养18-24小时，提取质粒，经测序发现该质粒即为质粒pDKSlO，说明菌株DH5 a /pDKSlO确实含有pDKSlO。菌株DH5 a /pDKSlO即为对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌有交叉保护作用的疫苗菌株。作为对照，将质粒PBT3按照同样方法转化入大肠杆菌DH5，得菌株DH5 a /pBT3,即为对照菌株。
实施例3疫苗的应用步骤I)疫苗制备液的制备。将上述所得疫苗菌株DH5 a /pDKSlO和对照菌株DH5 a /pBT3在LB液体培养基中培养至0D_为0. 8_1，而后将培养液离心(5000g，4°C，lOmin)，收集菌体，将其分别悬浮于PBS中至终浓度为lxl08cfu/ml，即为疫苗制备液和对照液。
步骤2)疫苗的接种。将120条牙鲆(每条重约12. 2g)随机分为4组，每组30条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤I)的疫苗制备液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤I)的对照液。步骤3)迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养迟缓爱德华氏菌TXl和海豚链球菌G26至OD6tltl为O. 9，然后离心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌体。将迟缓爱德华氏菌菌体悬浮于PBS中至终浓度为4xl06cfu/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液；将海豚链球菌菌体悬浮于PBS中至终浓度为lxl08cfu/ml，即为海豚链球菌悬液。步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤2)的A和B组鱼，用上述步骤3)的海豚链球菌悬
液腹腔注射步骤2)的C和D组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，5条；B组，29条；C组，6条；D组，24条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS = IOOx (I-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故DH5 α /PDKSlO针对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的免疫保护效率分别为83%和75%。由此得出DH5 a /pDKSlO对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌具有良好的交叉免疫保护效应。
权利要求
1.ー种交叉保护疫苗，其特征在于交叉保护疫苗为质粒PDKSio转化大肠杆菌DH5 α获得的重组菌株。
2.—种权利要求I所述的交叉保护疫苗的应用，其特征在于所述疫苗在制备具有预防和治疗迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的交叉疫苗制剂中的应用。
3.按权利要求2所述的交叉保护疫苗的应用，其特征在于将所述质粒pDKSlO转化入大肠杆菌DH5 α得重组菌株经LB培养基培养至0D_为O. 8-1后溶于PBS。
全文摘要
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种细菌传递的迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的交叉保护疫苗。交叉保护疫苗为质粒pDKS10转化大肠杆菌DH5α获得的重组菌株。本发明所得疫苗对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌感染分别有83％和75％的保护效率。
文档编号A61K39/02GK102657856SQ20121006514
公开日2012年9月12日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者党伟, 孙黎, 胡永华 申请人:中国科学院海洋研究所
文档序号 :
【 851602 】
技术研发人员：孙黎,胡永华,党伟
技术所有人：中国科学院海洋研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：孙黎,胡永华,党伟
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