重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌疫苗的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种来源马腺疫链球菌的重组真核表达质粒的复合物在制备预防马腺疫链球菌病疫苗中的应用的技术领域。
【背景技术】
[0002]马腺疫{Stmgles、是由马腺疫链球菌引起马属动物的一种急性接触性传染病，主要是在马颈部和头部出现化脓性淋巴管炎。该病俗称喷喉或槽结、喉骨胀，是马腺疫链球菌引起的马属动物的一种急性、热性传染病。其特征是鼻咽等粘膜发生急性、卡他性、化脓性炎症和领下淋巴结的急性、化脓性炎症。该病在养马地区发病率高，呈世界性分布，几乎每年都要流行一次，不仅直接影响马匹的生长发育，还会导致马匹的死亡，已造成严重经济损失，该病目前仍然困扰着许多国家和地区养马业的发展。当前该病的防治多数情况下以抗生素治疗和环境卫生控制为主，尽管目前抗生素治疗仍然是控制马腺疫的主要手段，但对于目前采用的抗生素疗法还存在着问题，由于长期大量的滥用抗菌药物，致使耐药菌株不断出现，还会造成疫病不断暴发，人们也意识到单靠抗生素并不能从根本上解决马腺疫的感染问题。
[0003]马腺疫链球具有多种表面及内部蛋白，成为该菌重要的毒力因子，且具有良好的免疫原性，是该菌的重要保护性抗原。针对这些蛋白的抗体被证明对小鼠具有保护作用。这些表面蛋白往往具有多种生物学功能，能介导链球菌与宿主细胞的粘附作用，能够抑制机体吞噬细胞对链球菌的吞噬，可作为有潜力的免疫原。现有研宄结果表明，当以有些种类的马腺疫链球菌的蛋白联合免疫后可以增强其中单一蛋白的免疫强度，其效果好于单一蛋白单独免疫时的效果(/7ZocA M，Jacobsson K, Frykberg L, Hirst TR, FranklinA, Guss B, et al..1nfect Immun，2004，72:3228_3236)。蛋白联合免疫后可以增强单一蛋白的免疫强度，但也发现有些蛋白联合免疫后并未出现免疫效果增强的现象(/Uod M，Karlstrom A, Lannergard J, Guss B，Flock JL Vaccine, 2006, 24, 4144—4151)。
[0004]目前普遍认为疫苗在马腺疫的控制方面具有重要的作用。由于对马腺疫链球菌的致病和免疫机理仍缺乏足够的认识，国内外迄今亦未有高效的疫苗来防治该病。目前对马腺疫链球菌疫苗使用情况是灭活疫苗免疫效果较低且易引起不良反应，弱毒疫苗存在安全隐患。随着当前马产业的快速发展，马的饲养日趋规模化和集约化，马腺疫的危害日趋严重，各地在马腺疫防治方面迫切需要安全高效的疫苗。经文献检索可知，因此采用马腺疫链球菌来源的两种蛋白的重组真核表达质粒复合物就成为制备马腺疫链球菌病疫苗的一个技术关键。可见采用S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒复合物及其在马腺疫链球菌病免疫中应用具有现实的意义和作用。
【发明内容】
[0005]针对现有技术未见有关采用S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒复合物及其在马腺疫链球菌病免疫中应用报道的技术现状，本发明旨在提供一种重组真核表达组合质粒在制备马腺疫链球菌病药物的应用，有鉴于此，本发明提供了一种重组真核表达质粒复合物，该复合物是由S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒PVAXl-S和PVAXl-E以1:1的质量比组合而成。本发明的目的之一在于提供一种马腺疫链球菌来源的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物，其免疫后可诱导实验动物产生特异的体液免疫和细胞免疫，目的之二在于提供所述的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物的制备方法；目的之三在于提供的免疫保护力实验证明该重组质粒复合物能够提供预防马腺疫感染的疫苗。
[0006]为解决上述的技术问题，本发明通过以下技术方案实现。
[0007]本发明利用已分离的新疆地区马腺疫链球菌中克隆了 S和E蛋白的基因并将隆到真核表达载体PVAX-1中获得这两种抗原的真核重组表达质粒，转化至工程菌中并对该重组质粒提取并纯化，利用S蛋白和E蛋白这2种重组质粒产物PVAXl-S和PVAXl-E以1:1的质量比组合而成制备了预防马腺疫感染的疫苗，通过在实验动物中应用验证得知，其免疫抗体水平、细胞免疫水平和对实验动物小鼠的免疫保护效果好于每种重组质粒单独免疫，克服了单一抗原产生的免疫保护效果差的缺点，证明S和E不同重组质粒的抗原相组合后细胞免疫水平优于单一抗原单独免疫，本发明中组合后免疫保护率达83.3%，优于单一抗原单独免疫(66.7%)的免疫保护率，改善和克服当前前马链球菌疫苗使用过程中灭活疫苗免疫效果较低且易引起不良反应，克服了弱毒疫苗存在安全隐患，具有现实的作用和意义。
[0008]本发明具体提供了一种重组真核表达质粒复合物，该复合物是由S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒PVAXl-S和PVAXl-E以1:1的质量比组合而成，该重组真核表达组合质粒的具体制备方法步骤如下:
Cl)分别扩增S及E基因，将两个基因均用Xho I和BanR I内切酶酶切并纯化。
[0009](2)再将酶切纯化后的基因片段分别连接到经通0 I和BaniA I酶切后的真核表达载体中。
[0010](3)通过上述步骤将PCR扩增得到的SeM基因片段分别用Xho 1、BanR I酶切后的后连入经通ο 1、BanR I酶切后的真核表达载体PVAX-1，用T4DNA连接酶进行16°C过夜连接，连接产物转化至万.DH5a感受态细胞中。提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-S。
[0011](4)同理，通过上述步骤将PCR扩增得到的E蛋白片段分别用沿01、BanR I酶切后连入经通ο 1、BanR I酶切后的真核表达载体PVAX-1，用T4DNA连接酶进行16°C过夜连接，连接产物转化至万.DH5a感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-E。
[0012](5)通过上述步骤(3)和(4)分别将获得重组质粒转化至工程菌中并对该重组质粒提取并纯化，利用获得重组真核表达质粒S蛋白和E蛋白以质量比1:1混合而成重组真核质粒复合物。
[0013]进一步，本发明详实提供了上述重组真核表达质粒复合物的具体制备方法步骤如下:
(I)分别扩增S蛋白基因及E蛋白基因，将两个基因均用BamH I和通ο I内切酶酶切并纯化，扩增的S蛋白基因及E蛋白基因分别参见附后的基因序列表中的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2。
[0014](2)再将酶切纯化后的基因片段分别连接到经BamH I和通ο I内切酶酶切后的真核表达载体中PVAX-1，该载体具有SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
[0015](3)通过上述步骤将PCR扩增得到的S基因片段分别用Xho I, BanRl酶切后连入经沿ο 1、BanR I真核表达载体PVAX-1，用T4DNA连接酶进行16 °C过夜连接，连接产物转化至万.DH5a感受态细胞中。提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-S，该重组质粒具有SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列。
[0016](4)将PCR扩增得到的E蛋白基因片段分别用沿ol、I酶切后连入经Xhol、BaniA I真核表达载体PVAX-1，用T4DNA连接酶进行16°C过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5a感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-E，该重组质粒具有SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列。
[0017](5) S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物由PVAXl-S和PVAXl-E以质量比1:1混合而成。
[0018](6)所述的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物的制备方法为:在浓度为0.01mol/L、pH为7.2?7.4的PBS溶液中分别加入提取好的S蛋白和E蛋白重组真核表达质粒，按1:1质量比混合均匀后，即得S蛋白和E蛋白重组真核质粒的复合物，使PVAXl-S和PVAXl-E的终浓度为0.5mg/mL。
[0019]同时，本发明提供一种重组真核表达组合质粒在制备马腺疫链球菌病药物的应用，利用上述制备的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物，将PVAXl-S和PVAXl-E的终浓度为0.5mg/mL在制备马腺疫链球菌疫苗中的应用。
[0020]本发明中，上述S蛋白基因及E蛋白基因来源于已分离本地马腺疫链球菌流行菌株马腺疫链球菌{Streptococcus, equi subsp equi) XZl CGMCC N0.7830，该菌种同样为本申请人已于2013年6月28日在北京保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研宄所“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCN0.7830，并在前面申报专利中给予详细的披露和记载。
[0021]通过实施本发明具体的
【发明内容】
可以达到以下有益效果:
(I)本发明通过将S和E不同重组质粒的抗原相组合后免疫抗体水平与单一抗原单独免疫对比试验，通过免疫抗体水平检测，证明了 S和E不同重组质粒的抗原相组合后免疫抗体水平优于单一抗原单独免疫。
[0022](2)本发明通过将不同重组真核表达质粒S和E的抗原相组合后在淋巴细胞的细胞免疫水平与单一抗原单独免疫进行对比试验，通过SI刺激指数的比较结果，证明了不同重组质粒S和E的抗原相组合后细胞免疫水平优于单一抗原单独免疫。
[0023](3)本发明通过将PVAXl-S和PVAXl-E以质量比1:1混合而成S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物。通过在实验动物中应用验证得知，中将不同抗原S蛋白和E蛋白相组合后免疫保护效果好，免疫保护率高达83.3%，优于单一抗原单独免疫的免疫保护率66.7%。
[0024](4)本发明提供的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物的制备方法简单，可以用于制备马腺疫预防用疫苗，在马腺疫的预防与控制中有着良好的应用和开发应用前景。
【附图说明】
[0025]图1显示为构建的S重组质粒电泳结果图。图中，Ml为DNA Marker DL5000 ； I为重组质粒pVAXl-S双酶切产物；2为质粒pVAXl双酶切产物；3为S蛋白基因PCR扩增产物。
[0026]图2显示为重组质粒PVAXl-S Western_blot鉴定结果图。图中，M为蛋白标准分子量；1为PVAXl-S质粒转染细胞产物；2为PVAXl质粒转染细胞产物；通过重组质粒转染293T细胞后在相对分子质量约41kDa处特异表达了目的条带，与预期蛋白大小一致。
[0027]图3显示为构建的E蛋白重组质粒电泳结果图。图中，Ml为DNA Marker DL5000 ；I为重组质粒pVAXl-Ε双酶切产物；2为质粒pVAXl空载体双酶切产物；3为E蛋白基因PCR扩增产物。
[0028]图4显示为重组质粒PVAXl-E Western-blot鉴定结果图。图中，M为蛋白标准分子量；1为PVAXl-E质粒转染细胞产物；2为PVAXl空载体转染细胞产物；通过重组质粒转染293T细胞后在相对分子质量约26kDa处特异表达了目的条带，与预期蛋白大小一致。