基于胞外漆酶的工程菌及其实现方法

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基于胞外漆酶的工程菌及其实现方法
【专利摘要】一种基因工程领域的胞外漆酶的工程菌，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点和聚组氨酸标签的引物进行PCR扩增得到编码胞外漆酶的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列连接到表达载体，再将获得的连接产物转入大肠杆菌表达菌株内，获得胞外漆酶过表达重组菌株。本发明针对现有技术存在的由于胞外漆酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成，此外本发明通过在表达重组蛋白N端添加聚组氨酸标签的方法，提高蛋白活性的同时也保证了纯化后胞外漆酶的纯度；此外，本发明通过载体信号肽实现了目的蛋白的周质空间表达，提高了胞外漆酶的活性。
CGMCC NO.5706
2012.01.09
【专利说明】基于胞外漆酶的工程菌及其实现方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种生物基因工程【技术领域】的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于胞外漆酶的工程菌及其实现方法。

【背景技术】
[0002] 木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质，主要包括纤维素、半纤维素和木质素。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，它涉及众多酶系的参与。木质纤维素中的木质素是由四种醇单体 (对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇）形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有联结强化细胞的作用。此外，木质素也是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的亲和力。
[0003] 根据单体的不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素（S -木质素），由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素 (G -木质素）和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素（H -木质素）。一般而言，木质素在裸子植物主要存在类型为愈创木基木质素（G)，双子叶植物主要含愈创木基-紫丁香基木质素（G - S)，单子叶植物则为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素（G - S - H)。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。
[0004] 木质素单体同时含有多种活性官能团，如羟基、羰基、羧基、甲基及其它侧链结构。其中羟基在木质素中存在较多，以醇羟基和酚羟基两种形式存在，而酚羟基的多少又直接影响木质素的物理和化学结构，如能反映出木质素的醚化和缩合程度，同时也能衡量木质素的溶解性能和反应能力；在木质素的侧链上，有对羟基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、对羟基肉桂酸、阿魏酸等酯型结构存在，这些酯型结构存在于侧链的α位或 Y位。在侧链α 位除了酯型结构外，还有醚型连接或作为联苯结构的碳-碳联结。同酚羟基一样，木质素的侧链结构也直接关系它的化学特性。
[0005] 由于木质素的复杂结构、高分子量及高度疏水性，与纤维素与半纤维素相比，木质素的降解相对缓慢。已发现木质素降解酶主要有3类：漆酶（laccase)、锰过氧化物酶 (manganese peroxidase)和木质素过氧化物酶（lignin peroxidase)。漆酶作为一种多铜氧化酶（multiple copper oxidase),在木质素的降解过程中起到了十分关键的作用。
[0006] 灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)是一种广泛存在于土壤的细菌，具有很强的木质素降解能力并得到了研究者越来越多的关注。明确其降解木质素的分子机制，通过基因工程手段克隆并表达木质素降解关键酶，对于开发新型木质素降解酶制剂进而实现木质素乃至木质纤维素的快速降解具有重要意义。
[0007] 经过对现有技术的检索发现：中国专利文献号CN103305481A公开（公告）日 2013.09. 18,公开了一种发酵齿毛菌生产漆酶的方法。该方法包括在液体培养基中培养一色齿毛菌（Cerrena unicolor)，收集发酵液或/和菌丝体的步骤，所述一色齿毛菌 (Cerrena unicolor)的菌株号为GSM-01，其在保藏编号为CGMCC No. 7713。一色齿毛菌（Cerrena unicolor)GSM - 01CGMCC No. 7713 在 1. 0mmol/L Cu2+ 培养基中在 25°C发酵 192小时的一色齿毛菌（Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No. 7713的胞外漆酶产量为 2855. 00±41. 63U/mL发酵液。但该技术所产漆酶在高温、高pH等环境下难维持较高的生物学稳定性及活性，因此应用范围受限。
[0008] 中国专利ZL 201210144682. 4,公告日2013. 9. 25,公开了一株秸杆降解放线菌及其应用。该技术的結杆降解放线菌，属于灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)，保藏编号为CGMCC No. 5706。但该技术产量较低，难以满足生产需求。

【发明内容】

[0009] 本发明针对现有技术存在的由于胞外漆酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，提出一种基于胞外漆酶的工程菌及其实现方法，能够应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成，此外本发明通过在重组蛋白添加聚组氨酸标签的方法，方便了后期蛋白的纯化，可为胞外漆酶的规模化发酵生产提供一种新的途径。
[0010] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0011] 本发明涉及一种胞外漆酶的工程菌，该工程菌为外源表达胞外漆酶的大肠杆菌。
[0012] 所述的胞内胞外漆酶具体为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1 胞外漆酶的人工合成基因，即SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，编码该漆酶核苷酸序列为990bp，共编码329个氨基酸，其中信号肽切割位点位于N端第30与31个氨基酸之间。
[0013] 所述的 SEQ ID N0. 2 通过对灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1的漆酶基因进行密码子优化后得到的核苷酸序列，该灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101，所述的漆酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 所述的胞外漆酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。
[0015] 本发明涉及上述工程菌的实现方法，以人工合成的漆酶基因序列为模板，与含有酶切位点和聚组氨酸（HIS 1CI · Tag)标签的引物进行PCR扩增得核苷酸序列Seq ID N0. 2 ; 然后将扩增得到的基因序列连接到表达载体PET - 22b (+)，再将获得的连接产物转入大肠杆菌表达菌株内，获得胞外漆酶过表达重组菌株。
[0016] 所述的含有酶切位点和聚组氨酸（HIS1CI · Tag)标签的引物，即含有Msc I和BamH I酶切位点引物，具体包括：
[0017] Lac - Msc I - F ： GATGGCCATGCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATGCTACCGCTACCGCTCGTAC
[0018] Lac - BamH I - R：CGGGATCCTTAGTGAGCGTGACCCGGTTTTTC
[0019] 所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C延伸45s ;30个循环后68°C终延伸3min。
[0020] 所述的大肠杆菌表达菌株为TransB(DE3)大肠杆菌。
[0021] 本发明涉及一种胞外漆酶的工程菌的应用，将其进行胞外漆酶的体外高效表达，并用于造纸及污水处理中的木质纤维素降解过程中。技术效果
[0022] 现有胞外漆酶在灰略红链霉菌内为胞内酶且表达量很低，因此严重限制了其使用范围和效果；与现有技术相比，本发明提供了一种全新的胞外漆酶基因序列；通过构建外源表达载体，实现了胞外漆酶的外源高效表达，在重组蛋白N端添加聚组氨酸标签 (HIS 1CI · Tag)的方法并结合高浓度咪唑洗脱液，提高了蛋白洗脱的效率及纯度、保证蛋白生物学活性的同时也方便后续蛋白的纯化；此外，本发明通过载体信号肽实现了目的蛋白的周质空间表达，保证了胞外漆酶在如高温及碱性的特殊条件下具有更稳定的酶学特性。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1为灰略红链霉菌漆酶（Lac)信号肽预测图。
[0024] 图2为灰略红链霉菌漆酶（Lac)在不同碳源诱导下表达量示意图。
[0025] 图3为灰略红链霉菌漆酶（Lac) 3D空间模型示意图。
[0026] 图4为灰略红链霉菌漆酶（Lac)基因密码子优化前（a)后（b)使用率对比图。
[0027] 图5为灰色链霉菌漆酶（Lac)基因优化前后序列比对图
[0028] 图6为重组漆酶（HIS1CI · Tag)外源表达及其纯化验证图。
[0029] 图7为不同温度（30°C?80°C )处理后漆酶酶活性示意图。
[0030] 图8为不同pH值（3. 0?11. 0)溶液处理后漆酶酶活性示意图。
[0031] 图9为不同金属盐溶液处理后漆酶酶活性示意图。
[0032] 图10为不同酶活抑制剂处理后漆酶酶活性示意图。

【具体实施方式】
[0033] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1
[0034] 本实施例包括以下步骤：
[0035] 步骤1)灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)的分离及培养：灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)分离自上海市浦江镇收集的腐烂結杆，保藏编号为CGMCC No. 5706。将该菌种接种于LB液体培养基，32 °C培养48h。
[0036] 上述LB液体培养基组分为：蛋白胨10. 0g/L，酵母提取物5. 0g/L，NaCl 10. 0g/L， pH6. 8 - 7. 2。在液体培养基中加入15. 0 - 20. 0g/L琼脂即得LB固体培养基。
[0037] 步骤2)灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组DNA提取：收集 2. OmL菌液，12000rpm离心2min。弃上清,收集菌体沉淀，加入180 μ L溶菌酶（20mg/mL)和 20yL EDTA 溶液（0.5M，pH 8.0)，37°C处理 45min，加入 4yL RNase A(100mg/mL)，震荡混匀15s，室温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒（TIANGEN)操作说明完成剩余操作，得到高纯度基因组DNA。通过0. 8%琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保无明显RNA 条带，基因组条带清洗、完整、无降解、无污染。
[0038] 步骤3)灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组测序：确定全基因组鸟枪法（WGS)策略，采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度的文库，采用Illumina Mise q(2X250bp)平台进行测序。收集测序的原始数据，对带接头、低质量的数据进行过滤，随后采用Newbler version 2. 8对去除接头的测序数据进行从头拼接，构建contigs及 scaffolds,最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。
[0039] 步骤4)蛋白编码基因功能预测：采用Glimmer 3. 0软件对全基因组序列进行基因预测。基因预测模型选取自我训练基因预测模型，即提取拼装序列中最长的序列，以该序列作为基因预测模型训练的序列。然后以该序列构建的基因预测模型，对所有序列进行基因预测，设定开放阅读框的长度为ll〇bp，其余参数为Glimmer 3. 0的默认设置。
[0040] 步骤5)漆酶膜定位预测：采用SignalP 4. 1分别对漆酶氨基酸序列进行信号肽模拟预测，如图1所示。结果表明漆酶N端存在明显的信号肽序列，推测该酶为胞外酶，且信号肽切割位点位于第30个氨基酸（精氨酸）与第31个氨基酸（色氨酸）之间。
[0041] 步骤6)灰略红链霉菌总RNA的提取：将链霉菌JSD - 1接种于以水稻秸杆（纤维素、木聚糖、果胶、木质素或葡萄糖）为唯一碳源的无机盐培养基，32°C、150rpm条件下培养72h。离心收集菌体沉淀，并按细菌总RNA提取试剂盒要求（TIANGEN)提取高纯度的链霉菌总RNA。
[0042] 上述无机盐培养基组分为：ΚΝ032· 0g/L，ΚΗ2Ρ041· 0g/L，NaCl 0· 5g/L， MgS04 · 7H200. 5g/L，CaCl2 · 2H200. lg/L，FeS04 · 7H20 0· 01g/L，水稻秸杆（纤维素、木聚糖、果胶、木质素或葡萄糖）10. 〇g/L。
[0043] 步骤7)灰略红链霉菌漆酶表达水平测定：
[0044] 根据漆酶基因序列，通过DNAMAN 6. 0软件设计特异性PCR引物，引物序列如下：
[0045] Lac - F ： CACCCAGCAGAACAAGAGCG
[0046] Lac - R ：GTGGTCGTGGTAGTGCCAGT
[0047] 同样的，根据16S rRNA的特异性序列设计引物，并作为内参基因，引物序列如下：
[0048] 16S rRNA - F ：CGTATTCACCGCAGCAATGC
[0049] 16S rRNA - R ：GCGAGGTGGAGCGAATCTCA
[0050] 以链霉菌总RNA模板进行反转录获得cDNA文库，并按照荧光定量PCR试剂盒 (TaKaRa)要求进行相关操作。设置三个重复，待实验完成收集处理数据，分析在不同碳源诱导作用下，漆酶的表达量（如图2)。结果表明，当以水稻秸杆（主要成分为木质纤维素）与木质素为碳源进行诱导时，该漆酶的表达量显著上调，证明该酶参与木质素的代谢过程。
[0051] 上述的荧光定量PCR的反应条件为：95°C预变性30s ;95°C变性10s，60°C退火 30s，72°C延伸15s，共40个循环。
[0052] 步骤8)漆酶3D空间模型预测：运用PHYRE 2在线程序对漆酶3D空间模型进行预测，结果如图3所示。结果表明该漆酶与PDB数据库中已知空间结构的蛋白模型的最高覆盖度与相似度分别可达96%和90%，预测结果具有100%可信度。通过气3D空间建构可以推测其N端（蓝色）适合连接融合标签，因其裸露在外面利于蛋白的后期纯化。
[0053] 步骤9)漆酶基因序列密码子优化：采用JCat对该漆酶基因序列进行密码子优化，以减少其密码子中GC含量、存在的茎环结构，同时在优化后基因序列中要避免出现转录终止位点和转录起始位点。经优化，基因 GC含量由69. 3%降为55. 4%，自由能由-408. 9kcal/ mol降为-250. 5kcal/mol，且基因的密码子使用率由0· 309提高至1. 0(图4)，说明经优化后的漆酶基因序列中密码子均为大肠杆菌偏爱密码子。图5为优化前后基因序列的对比图 (Lac为原始基因序列；CO - MC0为优化后基因序列）。
[0054] 步骤10)漆酶表达载体构建：根据漆酶基因序列，设计含有酶切位点和聚组氨酸 (HIS 1CI · Tag)标签的引物，序列如下：
[0055] Lac - Msc I - F : GATGGCCATGCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATGCTACCGCTACCGCTCGTAC
[0056] Lac - BamH I - R ：CGGGATCCTTAGTGAGCGTGACCCGGTTTTTC
[0057] 以灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组DNA为模板，用含有Msc I和BamH I酶切位点引物进行PCR扩增获得漆酶基因序列，使用DNA A -Tailing Kit加 A 后连接到T - Vector PMD? 19 - T (TaKaRa)，并将连接产物转入DH5 α大肠杆菌内。挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。Msc I和BamH I进行双酶切（37°C)，回收漆酶基因片段Lac。用相同内切酶酶切表达载体pET-22b (+)并回收载体DNA片段。将Lac与载体片段混合， T4DNA Ligase(TaKaRa)过夜连接（16°C)，将连接产物转入DH5a大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落PCR筛选含有目的基因表达载体的阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素（1〇〇 μ g/mL)的LB液体培养基中，180rpm、37°C培养16小时后提取质粒。
[0058] 上述PCR扩增条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C延伸45s ;30个循环后68°C终延伸3min。
[0059] 步骤11)漆酶过表达转基因菌株的构建：将上述漆酶表达载体转入TransB(DE3) 大肠杆菌，在含有氨节青霉素（100 μ g/mL)、卡那霉素（25 μ g/mL)及四环素（10 μ g/mL)的 LB固体培养基上筛选，获得漆酶过表达菌株。
[0060] 上述的TransB(DE3)具有以下特征：该菌株具有卡那霉素（KanK)和四环素（Tet K) 抗性，此外该菌株还包含突变的硫氧还蛋白还原酶（trxB)和谷胱甘肽还原酶（gor)基因，表达主要还原途径的两个关键酶。有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。
[0061] 步骤12)重组漆酶体外过表达与纯化
[0062] 挑取阳性克隆于含有氨苄青霉素（100yg/mL)、卡那霉素（25yg/mL)及四环素 (10 μ g/mL)的LB液体培养基中，在28°C震荡培养，当0D6QQ达到0· 8 - 1. 0时，加入IPTG和 CuS04溶液使其在发酵液中的浓度分别达到25 μ Μ和100 μ M，20°C继续培养20小时进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用 1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波破胞至菌液澄清， 13000rpm/min离心15min收集上清，上清液即为漆酶的粗酶液。收集上清液，经0. 45μηι醋酸纤维素膜过滤，之后使用Ni -ΝΤΑ Resin(TRANSGEN)进行蛋白纯化，并使用含有不同浓度 (100mM、200mM、250mM、300mM、350mM及400mM)咪唑的洗脱液对纯化后的蛋白进行洗脱。
[0063] 重组菌诱导表达漆酶的SDS - PAGE验证
[0064]制备 12% SDS -PAGE 胶，将粗酶液与 5XSDS -PAGE Loading Buffer 比例混合，与沸水浴5min，每个点样孔上样20 μ L，在160V电压下电泳60 - 70min，直至溴酚蓝指示条带完全跑出胶。停止电泳，用考马斯亮蓝R - 250溶液染色20min，然后用脱色液进行洗涤，直至背景色完全脱去，条带清晰可见（如图6a和6b)。结果显示经过优化，已经成功表达出明显的漆酶条带，且在300mM咪唑的洗脱液作用下，洗脱效果最佳。
[0065] 所述的12% SDS - PAGE是由浓缩胶与分离胶构成的，其组分为：分离胶：蒸馏水 1.6mL，30% 丙烯酰胺溶液 2.0mL，1.5M Tris -HCl(pH 8.8)1.311^，10%过硫酸铵 (APS)O. 05mL，10% SDS 溶液 0· 05mL，TEMED 0· 002mL ;浓缩胶：蒸馏水 0· 68mL，30%丙烯酰胺溶液〇· 17mL，1. OMTris -HC1 (pH 6· 8)0. 13mL，10%过硫酸铵（APS)O. OlmL，10% SDS 溶液 0. OlmL, TEMED 0.OOlmL ；
[0066] 所述的 5XSDS - PAGE Loading Buffer 组分为：1M Tris - HC1 (pH 6. 8) 1. 25mL， SDS 0· 5g，溴酚蓝25mg，甘油2. 5mL，去离子水定容至5mL。小份分装（500 μ L)后与室温保存，使用前每小份加入β -巯基乙醇25 μ L。
[0067] 所述的考马斯亮蓝R - 250溶液组分为：考马斯亮蓝R - 2501g，异丙醇250mL，冰醋酸100mL，去离子水650mL。
[0068] 所述的脱色液组分为：冰醋酸lOOmL，无水乙醇50mL，去离子水850mL。
[0069] 重组菌诱导表达猛氧化物酶的Western Blot验证，步骤如下：
[0070] 按顺序组装转膜装置：正电极、海绵、三张滤纸、PVDF膜、SDS - PAGE胶、三张滤纸、海绵和负电极。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡10min，滤纸用电转液浸泡。将装好的转膜装置放入电转槽，4°C 100V转60 - 70min。
[0071] 所述的SDS - PAGE胶是指：实施例12中已完成电泳、未染色的胶块；所述电转液的组分为：甘氨酸2. 9g/L，Tris5. 8g/L，SDS 0. 37g，甲醇200mL，去离子水800mL，配好之后 4°C预冷。
[0072] 封闭：将转好的PVDF膜置于封闭液中，并置于水平振荡器上室温封闭lh。
[0073] 所述封闭液组分为：5. 0g脱脂奶粉溶解于100mL TBST缓冲液；所述的TBST缓冲液组分为：NaCl 8. 8g，1M Tris - HC1 (pH 8. 0) 20mL，吐温-200. 5mL，去离子水 980mL。
[0074] -抗杂交：将封闭完的PVDF膜转入一抗溶液中，置于滚动摇床37°C、150rpm孵育 lh〇
[0075] 所述的一抗溶液组分为：将抗His -兔多克隆抗体以1 :5000溶在封闭液中。
[0076] 洗膜：将一抗孵育完的PVDF膜转入TBST缓冲液中，在摇床上震荡清洗3次，每次 l〇min ;之后再在TBS缓冲液中清洗1次，10min。
[0077] 所述TBS缓冲液是指不含吐温-20组分的TBST缓冲液。
[0078] 二抗杂交：将冲洗干净的PVDF膜放入二抗溶液中，置于滚动摇床37°C、150rpm孵育lh。
[0079] 所述的二抗溶液组分为：将羊抗兔IgG - HRP以1 :5000溶在封闭液中。
[0080] 洗膜：同前。
[0081] 染色：将染色液均匀涂抹于PVDF膜上，静置lmin。通保鲜膜包好PVDF膜，置于X -光片盒中，并用透明胶带固定。
[0082] 所述的染色液组分是将EasySee Western Blot Kit(TRANSGEN)中 500μ L溶液A、 500 μ L溶液B与1 μ L溶液C混合。
[0083] 显影：于暗室中压片洗膜显影，结果如图6c。
[0084] 重组漆酶在不同条件下生物学活性测定：采用以ABTS为底物测定漆酶酶活。反应条件为：在2mL含0. 5mM ABTS的0. ImM醋酸钠缓冲液（pH5. 0)，加入lmL酶液后启动反应，测λ = 420nm处吸光度变化，ABTS氧化产物在420nm处的ε = 36000dm3M_1/cm，l个酶活力单位用每分钟1 μ mol的ABTS被转化所需的酶量。
[0085] 采用上述方法测定在不同温度（20°C -80°C )下孵育12h、不同pH值（3. 0 -12. 0) 下孵育 7d、ImM 金属离子（Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu 2+、Hg2+、Cd2+、Fe2+)及 ImM 酶活性抑制剂（DTT、EDTA、SDS、NaN3)处理lh后，漆酶粗酶液的残存活性。测定结果表明（图7)，随着温度升高，漆酶的稳定逐步下降。在温度为70°C时，该漆酶的半衰期可达2h以上，证明该漆酶对高温有很强的耐受力。图8结果表明，该漆酶在pH为10. 0时稳定性最强，而在酸性条件下稳定性大大降低，如pH为3. 0时，漆酶1天内便已基本失去活性。该结果反应该漆酶对碱性环境有较完整的生物学活性。
[0086] 此外，该漆酶对多种金属离子（Na+、Mg2+、Ca2+、Mn 2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+)及酶活性抑制剂（DTT、SDS、NaN 3)有较强的耐受能力（图9和图10)。其中Mn2+与Cu2+甚至可提高漆酶活性。但是漆酶作为金属酶类，其对EDTA等金属离子螯合剂则非常敏感。综上酶学特性，证实该酶在如造纸及污水处理等行业具有广泛的应用前景。
【权利要求】
1. 一种胞外漆酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达胞外漆酶的大肠杆菌；所述的胞内胞外漆酶具体为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l胞外漆酶的人工合成基因，即SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，编码该漆酶核苷酸序列为990bp，共编码329个氨基酸，其中信号肽切割位点位于N端第30与31个氨基酸之间。
2. 根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的SEQ ID NO. 2通过对灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens)JSD - 1的漆酶基因进行密码子优化后得到的核苷酸序列，该灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l,现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9 日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101，所述的漆酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. -种根据权利要求1或2中所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点和聚组氨酸标签的引物进行PCR扩增得到编码胞外漆酶的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列连接到表达载体PET - 22b (+)，再将获得的连接产物转入大肠杆菌表达菌株内，获得胞外漆酶过表达重组菌株。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点和聚组氨酸标签的引物即含有Msc I和BamH I酶切位点引物，包括： Lac - Msc I - F : GATGGCCATGCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATGCTACCGCTACCGCTCGTAC Lac - BamH I - R :CGGGATCCTTAGTGAGCGTGACCCGGTTTTTC。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性 311^11;981：变性1〇8,681：延伸458;30个循环后681：终延伸31^11。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为TransB(DE3)大肠杆菌。
7. -种根据上述任一权利要求所述的胞外漆酶的工程菌的应用，其特征在于，将其进行胞外漆酶的体外高效表达，并用于造纸及污水处理中的木质纤维素降解过程中。
【文档编号】C12N1/21GK104232557SQ201410462414
【公开日】2014年12月24日申请日期:2014年9月12日优先权日:2014年9月12日
【发明者】周培, 冯海玮, 孙玉静, 支月娥申请人:上海交通大学

文档序号 : 【 487033 】

技术研发人员：周培,冯海玮,孙玉静,支月娥
技术所有人：上海交通大学

备注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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周培丨冯海玮丨孙玉静丨支月娥丨上海交通大学

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