油菜热激蛋白基因hsp17.8及其应用的制作方法
专利名称：：油菜热激蛋白基因hsp17.8及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域。具体地说，本发明涉及一种油菜热激蛋白基因HSP17.8，本发明提供了这个基因的核酸序列以及蛋白序列，同时还涉及该基因在作物耐热育种中的用途。油菜热激基因HSP17.8在拟南芥中的过量表达表明，此基因可显著增强植物的耐热性，为高温逆境下提高作物的产量提供保证。
背景技术：
：植物在生长发育过程中往往会受到各种非生物因子的胁迫，其中温度是影响植物生长的主要因子。随着工业化进程的加快，全球生态环境恶化，温室效应导致全球气温升高，20世纪全球平均气温已经上升0.6'C，而且预计到本世纪末全球气温仍将上升1.4-5.8°C。同时，极端性天气现象(如夏季高温等)在全球许多区域将出现得更加频繁，且持续时间更长。在许多地区，高温已成为影响作物生长的主要因素，对农作物的危害不仅表现在产量降低，而且严重影响品质。对高温下植物生理变化的分析研究表明植物的光合作用能力被抑制、细胞膜系统的稳定性受到损伤、细胞老化和死亡；细胞蛋白质广泛降解和凝集，导致所合成的蛋白质错误折叠和现有蛋白质的变性同时，研究表明，在高温胁迫下，所有生物都将产生热激反应(Heatshockresponse)。超过适宜生长温度1015。C(亚致死范围)，植物热激反应即被诱导，基因表达全局转换，其中大多数基因的表达下降或者削弱，而热激基因迅速地高水平表达，使热激蛋白(HeatShockProteins,HSP)合成迅速增加以恢复正常的细胞活性和生理活性，保护细胞和生物体免受严重损害。热激蛋白的作用很容易使人类认识到植物耐热性的获得与热激蛋白表达积累的关系。因此，有关热激蛋白基因研究在很多实验室展开，并获得了重要进展。HSP广泛存在于植物细胞膜、细胞质、叶绿体、线粒体等组织中，是一组结构保守的蛋白质，根据同源程度及分子量大小可分为HSP100,HSP90，HSP70,HSP60，HSP40,小分子HSP及泛素等亚家族(PappE,NardaiG,SotiC,CsermelyP.Molecularchaperones,stressproteinsandredoxhomeostasis.Biofactors,2003,17:249-257)。HSP通过2个途径以分子伴侣的方式减少热胁迫对细胞造成的有害影响(1)协助蛋白质跨膜运输，防止蛋白质前体积累，与未折叠蛋白质形成络合物以维持其转移能力；(2)维持蛋白质的正常折叠状态，促进错误折叠的蛋白质降解；在蛋白质从头折叠及应激条件下能起到稳定多肽链、防止蛋白质失活的作用。它参与靶蛋白活性和功能调节，但不是靶蛋白的组成部分。不同的HSP对靶蛋白的作用机理可能不同。sHSP蛋白家族是一类属于分子伴侣超级家族的分子量为12-40kDa的热激蛋白，也是目前为止植物中最为复杂和重要的一类HSP。在高等植物中极为丰富，均为核基因编码，基于不同的氨基酸序列结构分属于7个多基因家族，其中I、II类sHSP存在于细胞溶质中，III类则定位于细胞核中，其余4类分别存在于叶绿体、内质网、线粒体和过氧化物酶体中。在体外实验中，sHSP以不依赖ATP的方式结合在部分未折叠的蛋白上，阻止它们发生不可逆的降解。在sHSP的帮助下，依赖于ATP的大分子量热激蛋白帮助未折叠蛋白重新折叠并发挥作用(StuderSandNarberhausF-Chaperoneactivityandhomo-andhetero-oligomerformationofbacterialsmallheatshockproteins.JBiolChem，2000,275:37212-37218)。在目前所提出的sHSP功能模型中，sHSP多聚体分解成二聚体并通过保守区域和非保守区域结合蛋白。除作"分子伴侣"的功能之外，sHSP同样被认为可以调节膜脂的组成和流动性。体内界定植物sHSP的功能仍存在很大的困难，因为几乎所有的sHSP在热激条件下都大量表达。同时，拟南芥sHSP突变体非常有限，这在一定程度上限制了sHSP的研究。尽管如此，sHSP的研究仍然开展的如火如荼(SachinKotak，JaneLarkindale，UngLee，PascalvonKoskull-Doring,Complexityoftheheatstressresponseinplants.CurtOpinPlantBiol，2007,10:310-316)。研究表明很多植物sHSP不但在热激时表达，同时也可能会在其它逆境胁迫时表达。番茄sHSP，tom66和tomlll可被低温诱导，HSP21被发现包含在抗氧化途径中，I类AtHSP17.6A则可被渗透压所诱导，转基因研究发现细胞质中II类sHSP17.7在水稻中的过量表达不但提高了转基因株系的耐热性，同时其抗紫外线能力增强。定位于线粒体sHSP的过量表达提高了烟草的耐热性。叶绿体的sHSP的过量表达提供了可以保护番茄和烟草中光合系统II的证据，月季中I类sHSP17.5的突变体失去了获得性耐热的表型。另外，sHSP热激时积累虽然可以保护细胞不被损伤，但可被诱导的sHSP常温下过量表达不一定都会提高高温下的耐热性，过量表达HSP21的转基因株系仅仅是在强光条件下才能提高其耐热性，Sun等发现AtHSP17.6A的过表达仅仅提高了拟南芥在干旱和盐胁迫下的渗透能力。目前为止，还未发现过有关I类SHSP过量表达提高植物耐热性方面的报道。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种油菜热激蛋白基因HSP17.8，本发明提供了这个基因的核苷酸序列和氨基酸序列，如SEQIDNO:1所示的DNA序列，包括与SEQIDNO:1所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列；也包括在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物。本发明中的SEQIDNO:2所示的蛋白质属于小分子热激蛋白，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸可以获得功能类似物。因此，本发明也包括与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列至少70%同源性的序列。本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜热激蛋白基因HSP17.8在提高拟南芥(植物)耐热性中的应用。为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术措施油菜热激蛋白基因HSP17.8及与油菜70%同源的拟南芥HSP17.8的获得1)自一对耐热性存在差异的油菜品系中差减得到该基因EST序列，在NCBI数据库中检索已发表的拟南芥HSP17.8基因序列(ATlg07400)，并以此编码区序列BLASTNCBIEST数据库，寻找与之同源的油菜HSP17.8基因的EST序列，并设计基因编码序列的两侧引物(正向引物[5'-ATGTCGTTGATTCCAAGCTTC-3'];反向引物[5，-TCAGCCAGAGATCTGGATAG-3，])。拟南芥HSP17.8基因根据数据库中的序列设计引物(正向引物[5'-ATGTCGCTTATTCCAAGCTTC-3'];反向引物[5'-TTAGCCAGAGATATCAATAG-3，])。2)以油菜、拟南芥cDNA第一链为模板进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得油菜及拟南芥HSP17.8基因序列，一种DNA分子，油菜碱基序列如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，拟南芥基因序列与数据库中己发表的相同。通过上述方法获得了油菜及拟南芥热激蛋白基因HSP17.8，采用一种提高HSP17.8表达活性的转基因拟南芥，其特征在于转基因植物表现为HSP17.8含量增加，比受体对照(非转基因植株)的耐热性有所增强。其具体技术措施是提供了一种PCR8/GW/T0P0质粒(invitrogen公司，商业途径获得)，可以与表达载体质粒重组构建基因表达质粒。提供了一种质粒表达载体Pearleygate100(invitrogen公司，从商业途径获得)，它含有35S启动子和翻译控制件。提供了一种可在植物中表达的宿主菌，农杆菌(根癌农杆菌GV3101，invitrogen公司，商业途径获得)。本发明提供了一种能够过量表达HSP17.8的转基因拟南芥的方法，其特征在于拟南芥中HSP17.8含量增加。其应用过程包括下列步骤1)将克隆得到的油菜、拟南芥热激蛋白基因HSP17.8分别与PCR8/GW/T0P0质粒连接，命名为t叩o-Bnhspl7.8和topo-Ahsp17.8，利用PCR8/GW/T0P0质粒与质粒表达载体Pearleygate100可以体外重组的特性将热激蛋白基因HSP17.8转移至表达载体，命名为Pearleygate100-Bnhspl7.8和Pearleygatel00-Ahsp17.8;2)将步骤1)中制备的载体Pearleygate100-Bnhspl7.8和Pearleygate100-Ahspl7.8转入根癌农杆菌GV3101，再导入拟南芥植株中；3)筛选阳性植株。种植拟南芥TO代所收获的种子，待10天左右喷洒除草剂(Liberty,Invitrogen公司)用于筛选阳性植株，叶片DNA提取后进行PCR鉴定，最终确认基因已入的阳性植株。本发明中所用的术语"转基因植物"是指含有导入的基因并能够稳定地增强或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。本发明中所提到的植物包括水稻、小麦、玉米等受高温逆境影响较大的粮食作物，也包括油菜、大豆、棉花等经济作物，还包括夏季生长的黄瓜、番茄等蔬菜作物。克隆本发明中所述的热激蛋白基因HSP17.8的方法是本领域中所常采用的方法。提取植物叶片DNA是常用的分子生物学技术，提取mRNA的方法也有多种成熟的技术，试剂盒(TRIzolReagent)可从商业途径获得(Invitrogen公司)，而构建cDNA文库也是常用的分子生物学技术。构建本发明中所述的载体构建和将载体转染入植株所用到的酶切、连接、花序侵染等方法也是本领域中常用技术。其中所涉及的质粒(入门载体PCR8/GW/T0P0，质粒表达载体Pearleygate100)，转染用媒体(如根癌农杆菌GV3101和所用试剂成分如蔗糖、6-BA等)可从商业途径获得。Hspl7.8基因作为小分子热激蛋白可发挥其分子伴侣的作用协助蛋白质跨膜运输，防止蛋白质前体积累，与未折叠蛋白质形成络合物以维持其转移能力；维持蛋白质的正常折叠状态，促进错误折叠的蛋白质降解；在蛋白质从头折叠及应激条件下能起到稳定多肽链、防止蛋白质失活的作用。以不依赖ATP的方式结合在部分未折叠的蛋白上，阻止它们发生不可逆的降解。在sHSP的帮助下，依赖于ATP的大分子量热激蛋白帮助未折叠蛋白重新折叠并发挥作用。在目前所提出的sHSP功能模型中，sHSP多聚体分解成二聚体并通过保守区域和非保守区域结合蛋白。除作"分子伴侣"的功能之外，sHSP同样被认为可以调节膜脂的组成和流动性。本发明的优点在于本发明是国内外首次公开油菜小分子热激蛋白基因HSP17.8序列，它属于细胞质I类小分子热激蛋白，目前其过量表达可提高植物耐热性的功能没有相关报道。本发明实验结果表明转基因拟南芥HSP17.8的含量与受体对照(非转基因植株)相比均有很大程度的提高，其耐热性也因此得到增强。因此本发明提出可利用HSP17.8的过量表达来增强植物耐热性以便用于农作物及蔬菜的抗热品种选育，由此减缓高温对经济作物产量和品质造成的伤害。图1植物表达载体示意图将HSP17.8基因编码区序列与PCR8/GW/T0P0质粒连接后筛选正向载体，获得PCR8/GW/T0P0-hspl7.8，然后PCR8/GW/TOP0-hspl7.8质粒与表达载体PearleygatelOO进行重组，并筛选阳性克隆获得Pearleygate100-hspl7.8。图2除草剂筛选过后的转基因植株示意图拟南芥花序侵染后的植株收获种子TO代，播种2周后喷洒除草剂筛选阳性植株。图3转HSP17.8基因拟南芥T1代的PCR鉴定结果示意图123为转油菜热激蛋白基因，ABC为转拟南芥热激基因，WT为对照野生植株。图4转基因植株与对照植株45t:高温处理后的比较示意图转基因植株与对照植株在24'C固体培养基生长一周后45'C高温处理1小时，再放置24'C恢复两周后的表型观察。图中可以看出野生型对照ffT无存活，转基因株系表现不同程度的耐热性。图5转基因植株与对照植株角果成熟期36'C高温处理后的比较示意图转HSP17.8基因株系在角果成熟期36。C高温生长2天后，野生型植株迅速变黄并枯萎，而转基因植株生长状态基本不变，表现出良好的耐热性。具体实施方式通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)，或Draper等人(Blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。1.一种油菜、拟南芥热激蛋白基因HSP17.8的获得在NCBI数据库中检索已发表的拟南芥HSP17.8基因序列，BLAST到油菜EST序列并拼接出油菜HSP17.8编码区全长。设计基因编码序列的两侧引物(正向引物[5，-ATGTCGTTGATTCCAAGCTTC-3，];反向引物[5，-TCAGCCAGAGATCTGGATAG-3'])，拟南芥HSP17.8基因根据数据库中的序列设计引物(正向引物[5，-ATGTCGCTTATTCCAAGCTTC-3，];反向引物[5，-TTAGCCAGAGATATCAATAG-3'])，用于从油菜和拟南芥中扩增HSP的对应序列。1、提取油菜、拟南芥mRNA。RNA的提取(TRIZ0LTMKit提取RNA)液氮研磨lOOmg材料A.加ltnlTRIZOL，室温(20-25。C，下同)放置5min。B.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。C.12000g，15min,4。C，取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀后室温放置15min。D.12000g，15min，4。C，去上清，加入lml70%(无水酒精与H20的体积比)乙醇。E.7500g，7min，4。C,去上清，空气千燥。F.DEPC—H20溶解。2、c副A第一链的反转录采用RevertAidHMinusFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas)，操作参照所用试剂盒说明进行。3、以cDNA为模板进行PCR扩增，得到了一种油菜热激蛋白基因HSP17.8，其碱基序列为SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。一种分离的蛋白质，其序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。2.油菜、拟南芥HSP17.8在提高拟南芥耐热性中的应用2.1HSP表达载体的构建及拟南芥的转化将PCR扩增得到的基因序列与T0P0入门载体(invitrogen公司)连接后，转化到感受态细胞DH5a(invitrogen公司)中，壮观酶素筛选，载体引物(T7引物)与基因引物(基因上游引物)扩增鉴定正向插入克隆，质粒经小量制备后与PearleygatelOO(invitrogen公司)进行重组，并转化到感受态细胞DH5a中，卡那霉素筛选，其插入片段经载体引物(35S启动字序列引物)与基因引物(基因下游引物)PCR鉴定，示意图见图A。拟南芥的转化过程-试剂配制渗透培养基(1L):1/2xMurashige-Skoog;5%(质量比)蔗糖;0.5克MES;用K0H调至pH5.7;再加10微升lmg/ml的6-BA母液；200微升SilwetL-77转化步骤(1)制备好已转化了相应质粒的农杆菌(根癌农杆菌GV3101)菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液0.D600当在1.2到1.6之间。(2)室温5000rpm离心15分钟。(3)弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使0.D600在0.8左右。(4)将整个植株直接浸泡至农杆菌悬浮液30s。(5)避光培养过夜，然后正常培养至结子。2.2转基因拟南芥的筛选和验证转化子的筛选将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。两天后人工模拟自然条件光照(光照16小时，暗8小时)，三天后揭膜。人工培养室条件相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8h黑暗、16h光照培养。一周左右，喷除草剂筛选阳性植株。PCR鉴定(1)用于PCR的转化植株总DNA的提取A.70%(体积比)乙醇擦洗叶片，称取大约100mgB.加入600ul抽提缓冲液(O.2MTris—Cl，0.25NaCl，25mMEDTA，0.5%SDS，pH7.5)，室温快速研磨。C.1.5mlEpendorff管中涡旋混匀5-10s。D.12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，一20摄氏度沉淀过夜。E.12000rpm，15min，室温。加入70°/。乙醇200ul泡洗DNA沉淀。F.12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。G.加无菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。H.以总DNA为模板，进行PCR。(2)PCR程序PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，依据植物表达载体中目的基因及其上游35S启动子序列和基因下游引物[5'-TCAGCCAGAGATCTGGATAG-3']，反应的时间和温度作如下94。C3tnin94。C45s，59。C45s72°C2min30s，30cycles72°C5min检测结果显示，大多数转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带，而阴性对照则没有，表明转基因拟南芥基因组屮已经含有外源基因DNA片段，结果如图C示。2.3拟南芥热激实验转基因Tl代植株于MS固体培养基中23'C/2rC，16/8小时生长一周后45'C热激1小时，两周后观察植株存活状态。实验结果表明，转基因植株相对于野生型拟南芥在高温处理后成活率更高，耐热性明显提高(图4)。转基因T2代植株生长至角果成熟期时放入36'C高温生长2天后，与转基因植株相比野生型植株迅速变黄并枯萎(图5)。转基因株系高温生长实验结果显示，在23'C/2rC环境中，转基因及野生型拟南芥种子产量无明显区别，而在32'C/3CTC环境中，转基因植株与对照植株在产量有较明显的区别。在30'C—32'C环境中，野生型株系的产量比正常条件下降低了30°/以上，而转基因株系与正常条件下相比降低了不到l(m(表l)。表l转基因拟南芥在不同温度下产量的变化<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>SEQUENCELISTING<110>中国农业科学院油料作物研究所<120>油菜热激蛋白基因HSP17.8及其应用<130>油菜热激蛋白基因HSP17.8及其应用<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>472<212>DNA<213>油菜<400>1atgtcgttgattccaagcttcttcggcaac犯ceiggcgcggCggC服C3gcttcttcgat60cctttttctcttgatgtttgggatccgttcaaggactttccatcatcttcttcgttttca120cggg卿actccgcgattgtg咖gcgcgtgtggactggsggg卿ctcctgacgcgcac180gtgttc卿gcggacttgcctggscttaag卿gsgg卿tg犯ggtgga240gac柳gtgccgg聊g柳cacgtgg卿g犯cgacacg300tggcaccgcgttgagsgatcg3gCgggC3gttcacgagg￡iagtttaggcttcctga犯at360gtg3卿tggatC3ggtg肌柳tgcgatggag咖ggtgtgctgactgtgacggtgcct420犯ggccg卿ccaagaagcctgstgtteagtctatccagatctctggctg犯472<210>2<211>153<212>PRT<213>油菜<400>2MetSerLeulieProSerPhePheGlyAsnAsnArgArgGlySerAsnSerPhePheAsp5101520ProPheSerLeuAspValTrpAspProLeuArgGluPheSerSerLeuSerArgAspAan25SerAlalieValAsnAla45AlaAspLeuProGlyLeu65LeuLyslieSerGlyGlu85ValGluArgSerSerGly105AspGinValLysAlaAla125ThrLysLysAlaAspVal1453035ArgValAspTrpArgGluThrProGlu5055LysLysGluGluValLysValGlulie7075ArgHisValGluLysGluAspLysAsn9095GinPheThrArgLysPheArgLeuPro110115MetGluAsnGlyValLeuThrValThr130135LysSerlieGlulieSerGly15040AlaHisValPheLys60GluGluAspSerVal80AspThrTrpHisArg100GluAsnValLysMet120ValProLysAlaGlu140权利要求1、一种油菜热激蛋白基因HSP17.8，其碱基序列为SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2、一种分离的蛋白质，其序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3、权利要求1所述的一种油菜热激蛋白基因HSP17.8在提高拟南芥耐热性中的应用。全文摘要本发明公开了一种油菜热激蛋白基因HSP17.8及其应用。本发明提供了这个基因的核苷酸序列和氨基酸序列，也包括其它作物中与SEQIDNO1所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列；还包括在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物。同时本发明还借助于模式植物拟南芥，通过转基因技术证实此热激蛋白基因的过量表达增强了拟南芥在高温下的耐热性，并提高了高温下种子的收获量，改善了高温逆境中拟南芥的产量，因此本发明在作物抗热育种中有很好的应用前景。文档编号C12N15/82GK101544983SQ200910061810公开日2009年9月30日申请日期2009年4月24日优先权日2009年4月24日发明者静刘,刘贵华,玮华,庆杨,王新发,王汉中申请人:中国农业科学院油料作物研究所
文档序号 :
【 573044 】
技术研发人员：王汉中,华玮,刘静,刘贵华,王新发,杨庆
技术所有人：中国农业科学院油料作物研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：王汉中,华玮,刘静,刘贵华,王新发,杨庆
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