一种高产菊粉内切酶的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，所述菌株命名为毕赤酵母（Pichia?pastoris）GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC?NO：9049。本发明的菌株通过两种质粒pPIC9K和pGAPZαA将菊粉内切酶基因INU2多拷贝整合入毕赤酵母GS115基因组上，并从中筛选获得了高效表达菊粉内切酶的双启动子多拷贝酵母基因工程菌株。实验证实，该菌株在3L高密度发酵中菊粉酶酶活性可达3006U/ml，简单纯化的粗酶液即可直接用于水解菊粉产生低聚果糖，转化效率高，使其在工业中用菊粉酶解法生产低聚果糖成为现实，具有巨大的实用价值。
【专利说明】—种高产菊粉内切酶的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和发酵工程领域，涉及一种高水平表达菊粉内切酶单一酶组分的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株及构建方法与应用。
【背景技术】
[0002]菊粉是由β粉2，1-糖苷键连接的D-呋喃果糖分子组成的链状大分子，末端常含有一个葡萄糖基。菊粉酶(inulinase)是一种催化水解菊粉中β _2，1-呋喃果糖苷键的水解酶。根据其对底物的作用方式，可将其分为2类:一类是菊粉外切酶(exoinulinase)，它能从菊粉末端逐一切下一个果糖单位，产物为果糖及少量葡萄糖；另一类是菊粉内切酶(endoin μ linase)，它从菊粉分子内部随机切断某个β _2，1-糖苷键，水解产物为寡聚糖，可以用来生产低聚果糖。
[0003]低聚果糖(Inulooligosaccharides, 10S)是功能性低聚糖,在食品、医药等方面具有极大的应用价值，相比于蔗糖，具有难消化性、食物纤维的作用、低龋齿性、促进双歧杆菌的增殖、改善脂质代谢作用等优越性，适合现代人们对食品安全性、健康性及功能性等需求的特点，逐渐成为菊粉生物转化应用中极其重要的方向。
[0004]低聚果糖的生产方法主要有两种:一种是以蔗糖为原料利用呋喃果糖苷转移酶(Frucofranosidase)作用来制备,该方法的缺点是反应产物中生成大量的葡萄糖,通常占到35%以上，去除难度大，导致其生产成本的增加；另一种方法是以菊粉为原料利用微生物产出生产用的内切型菊粉酶酶解制备低聚果糖，该方法的优点势是只需一步酶解就可以生成80%以上的高纯度低聚果糖，产物中的葡萄糖含量极低，又由于菊粉的来源丰富，价格便宜，使得该方法具有非常广阔的应用前景。
[0005]用菊粉酶法生产低聚果糖的工艺，对微生物具有较高要求，首先微生物所产的酶液中只能有内切型菊粉酶，而不能有外切酶及转移酶的存在；第二是微生物所产酶液中菊粉酶的酶活力要高、稳定性要好。因此，获得优良的产菊粉内切酶微生物是以菊粉为原料用菊粉酶解法生产低聚果糖能否工业应用的关键。然而自然界菌株中已知具有上述功能菌株一般表达水平很低并且既表达菊粉内切酶也表达菊粉外切酶，使的大规模生产困难而且产物纯化成本很高，所以到目前为止，菊粉内切酶生产低聚果糖的工艺没有真正实现在工业生产中规模化应用。因此，通过生物技术开发出酶活力高、产量大、热稳定性好的产菊粉内切酶菌株意义重大。经检索，目前具有高水平表达菊粉内切酶单一酶组分的重组毕赤酵母菌株还未见报道。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种高水平表达菊粉内切酶单一酶组分的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株及构建方法与应用。
[0007]本发明的技术方案概述:分别构建组成型和诱导型两种启动子所调控的菊粉内切酶INU2基因的表达质粒，再将这两种质粒多拷贝整合在宿主巴斯德毕赤酵母的基因组上，获得高产菊粉内切酶的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，实现对菊粉内切酶INU2的高水平表达。
[0008]本发明所述的高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于:所述菌株命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNO:9049o
[0009]上述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，步骤是:
[0010]克隆菊粉内切酶基因INU2，将菊粉内切酶基因，通过限制性内切酶位点分别与毕赤酵母表达质粒PPIC9K和pGAPZ αΑ连接获得重组表达载体pPIC9K_INU2和pGAPZ a A-1NU2 ;然后将pP IC9K_INU2导入巴斯德毕赤酵母GSl 15中，通过遗传霉素G418筛选得到多拷贝AOX启动子的转化子，再将pGAPZ a A-1NU2导入多拷贝AOX启动子的转化子中，通过博来霉素抗性筛选获得多拷贝GAP启动子的转化子；用实时荧光定量PCR确定多拷贝转化子的拷贝数，对不同拷贝数的转化子进行诱导发酵比较，确定出产量最高的双启动子多拷贝转化子，即获得高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株。
[0011]上述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株的构建方法中:所述产量最高的双启动子多拷贝转化子优选是GS115-A3-G2，其中:GS115表示巴斯德毕赤酵母基因，A3表示有3个AOX启动子，G2表示有2个GAP启动子。
[0012]本发明所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌在水解菊粉用于生产低聚果糖中的应用。
[0013]将本发明所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌在3L高密度发酵中菊粉酶酶活性可达3006U/ml，简单纯化的粗酶液即可直接用于水解菊粉产生低聚果糖，转化效率高，在工业中用菊粉酶解法生产低聚果糖具有巨大的发展前景。
[0014]本发明的有益效果是:所述工程菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-A3-G2能够利用组成型和诱导型启动子调控菊粉内切酶INU2的高水平表达，可以无需甲醇诱导就可以高产菊粉内切酶INU2，在3L高密度发酵中，未经甲醇诱导，粗酶液(发酵上清液)酶活即可以达到800U/ml以上，可以通过组成型启动子来达到快速发酵获取菊粉内切酶INU2 ;也可以再用甲醇进行该菌株发酵的诱导，在3L高密度发酵中，甲醇诱导8~10天，粗酶液酶活可达到3000U/ml以上，酶蛋白分泌量在2g/L以上，预示可以用此来工业上大批量生产菊粉内切酶。并且提供的重组菌株所产的重组菊粉内切酶INU2可以直接作用于底物菊粉来生产高附加值的低聚果糖，具有巨大的商业应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]本发明所述巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-A3_G2,已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC NO:9049。
[0016]图1:重组质粒pPIC9K-1NU2的构建示意图。
[0017]图2:1NU2和GAPDH的标准曲线。
[0018]图3:多拷贝INU2转化子酶活曲线。[0019]图4:质粒pGAPZ a A-3INU2的构建方案图。
[0020]图5:质粒pGAPZ a A-1NU2的构建图。
[0021]图6:质粒 pGAPZ a A-2INU2 的构建图。
[0022]图1:质粒 pGAPZ a A-3INU2 的构建图。
[0023]图8:GS115-A3-G2的生长和酶活曲线。
[0024]图9:薄层层析结果图。
[0025]图10:1mageJ软件分析结果图。
【具体实施方式】
[0026]以下结合具体实施例，对本
【发明内容】
进行进一步说明。
[0027]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2002)中所述的条件进行。
[0028]本发明的实施例中使用了一下菌株和质粒:
[0029]大肠杆菌(E.coli DH5 α ):北京全式金生物科技有限公司。
[0030]无花果曲霉(Aspergillus ficuum) CGMCC3.4322:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0031]pPIC9K质粒:表达质粒，具有AOX启动子，遗传霉素(G418)抗性，购买于Invitrogen0
[0032]pGAPZ a A质粒:表达质粒，具有GAP启动子，博来霉素(Zeocin)抗性，购买于Invitrogen0
[0033]巴斯德毕赤酵母GS115:购买于Invitrogen。
[0034]实施例1:Α0Χ启动子菊粉内切酶INU2多拷贝重组毕赤酵母的构建
[0035]1.重组质粒pPIC9K-1NU2的构建
[0036]1.1基因组的提取
[0037]用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction KitCBioer Technology c0., Ltd.)提取无花果曲霉(Aspergillus ficuum) CGMCC3.4322的基因组，具体制备方法参考试剂盒的操作手册。
[0038]1.2基因INU2的克隆
[0039]将1.1提取的基因组作为PCR反应的模板，根据NCBI上已知的菊粉内切酶基因序列设计 I 对引物:INU2-EcoR I 上游:ACGCGAATTCCAGTCTAATGATTACCGTCCTT (划线部分为EcoR I 酶切位点)，INU2-Not I 下游:ATAGCGGCCGCTCATTCAAGTGAAACACTCC(划线部分为 NotI酶切位点)，进行PCR反应，克隆INU2。PCR扩增条件:预变性94°C 2min;98°C IOsec;退火55°C 30sec;延伸72°C 2min;35个循环；72°C延伸IOmin; 12°C保温。利用DNA纯化回收试剂盒(购买于天根生化科技(北京)有限公司)对目的基因产物进行回收，具体操作方法参考试剂盒操作手册。1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果。目的条带大小为1503bp。
[0040]1.3重组质粒pPIC9K-1NU2的构建
[0041]用限制性内切酶EcoR I和Not I分别对回收的目的基因产物INU2和质粒载体PPIC9K进行双酶切，利用DNA纯化回收试剂盒分别回收酶切后的INU2和质粒片段，然后利用T4连接试剂盒将这两个片段进行连接，形成重组质粒载体pPIC9K-1NU2。它的构建过程如图1。具体酶切和连接步骤，参考操作说明书。
[0042]1.4测序分析
[0043]将1.3中的连接液转化大肠杆菌(E.coli DH5a )，具体转化步骤参考说明书，获得的阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序分析，INU2的开放阅读框(ORF)包括1482bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码494个氨基酸。
[0044]经测序无误的阳性克隆表达质粒命名为pPIC9K-1NU2。
[0045]2.pPIC9K-1NU2电转毕赤酵母GSl 15及其多拷贝的筛选验证
[0046]2.1制备线性化质粒pPIC9K-1NU2
[0047]利用限制性内切酶Sacl/Sall对质粒pPIC9K_INU2进行酶切线性化，利用DNA纯化回收试剂盒进行回收，确保回收浓度在200ng/l.! I以上，保存备用。
[0048]2.2制备毕赤酵母GSl 15感受态细胞
[0049](I)接种毕赤 酵母单菌落到含有5ml YPD液体培养基中，30°C培养过夜；
[0050](2)转接培养液到含有50ml液体YPD的大三角瓶中，接种量1% (v/v)，30°C培养过夜，直到OD6qq=L 3~1.5 ;
[0051](3)在1500g，4°C条件下，离心培养液5min，沉淀用50ml冰浴的双蒸水重悬；
[0052](4)在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用25ml冰浴的双蒸水重悬；
[0053](5)在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用2ml冰浴的IM的山梨醇溶液重悬;
[0054](6)在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用Iml冰浴的IM的山梨醇溶液重悬，使菌悬液体积大约为1.5ml，得到毕赤酵母感受态细胞，每管80μ I于-80°C中保存备用。
2.3电转质粒
[0055](I)将2.2中制备的80 μ I感受态细胞和2.1中制备的5~20 μ g线性化质粒PPIC9K-1NU2加入到1.5ml预冷的离心管中，混匀。将反应液转移到预先冰浴的转化杯中；
[0056](2)冰浴装有转化液的转化杯5min ；
[0057](3)按照如下参数设置电转仪，进行酵母电转化:Cuvette Gap0.2cm ；Voltagel.5kV ；Field Strength7.5kV/cm ；Capacitor25 μ F;Resistor (pulse control)400 ；Time constant approximately9.0msec ；
[0058](4)脉冲后，立即向转化杯中加入1ml预冷的IM的山梨醇溶液，把转化液转移到一个新的1.5ml离心管中；
[0059](5) 30°C静置培养 I ~2h ;
[0060](6)分别吸取毕赤酵母GS115电转液50 μ 1，100 μ I, 150 μ 1，分别涂布在MD培养
基上;
[0061](7)30°C培养直至转化子出现。
[0062]2.4筛选不同遗传霉素G418抗性的转化子
[0063](I)吸取l-2ml无菌水于转化子平板上，用灭菌刮子将His4+转化子全部洗脱下来，将细胞悬液混合转移到灭菌的离心管中，用分光光度计测定浓度，得到0D_=5X IO7个细胞/ml的细胞悬液。
[0064](2)准备 10 个 YPD 平板，遗传霉素 G418 浓度分别为 0,0.25,0.5、1、1.5、2、2.5、3、
4、8mg/L，在每个YPD平板涂上IO5个细胞，置于30°C孵育，2~5天出现抗性克隆子。[0065](3)挑取步骤(2)中长出来的抗性单克隆子，接种于对应同抗性的YPD液体培养基中，30°C，200r/min,过夜培养，检测是否能够在该抗性压力下正常生长，如果长起来，则继续加大G418抗性，直至该克隆无法生长。
[0066](4)挑选出步骤(3)中检测出的具有明显不同G418抗性的单克隆转化子，用酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组，备用于实时荧光定量PCR实验，并保存菌株。
[0067]2.5实时荧光定量PCR确定转化子的INU2拷贝数
[0068](I)标准曲线的建立
[0069]根据文献的报道，GAPDH (甘油醛_3_磷酸脱氢酶)在毕赤酵母基因组中是单拷贝，因而选取GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因作为内参基因，根据NCBI上已知的GAPDH基因序列设计引物:GAP-上游:CACAATGGCTATCACTGTCG，GAP-下游:CACACTACAGCCCGCATT，以野生型GS115 (his4_)基因组作为模板，克隆GAPDH基因。将GAPDH基因构建到pEASY_T3载体上，获得重组质粒pEASY-GAP，操作方法参见pEASY-T3克隆盒的指导说明书。同样的方法，将目的基因INU2也构建到pEASY-T3载体上，获得重组质粒pEASY_INU2。
[0070]参考天根生化科技(北京)有限公司提供的荧光定量实验技术手册。用核酸定量仪检测提取的标准质粒PEASY-1NU2和pEASY-GAP的浓度，根据公式:
[0071]
【权利要求】
1.一种高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于:所述菌株命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNO:9049o
2.权利要求1所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，步骤是: 克隆菊粉内切酶基因INU2，将菊粉内切酶基因，通过限制性内切酶位点分别与毕赤酵母表达质粒PPIC9K和pGAPZ a A连接获得重组表达载体pPIC9K_INU2和pGAPZ a A-1NU2 ;然后将pPIC9K-1NU2导入巴斯德毕赤酵母GSl 15中，通过遗传霉素G418筛选得到多拷贝AOX启动子的转化子，再将pGAPZ a A-1NU2导入多拷贝AOX启动子的转化子中，通过博来霉素抗性筛选获得多拷贝GAP启动子的转化子； 用实时荧光定量PCR确定多拷贝转化子的拷贝数，对不同拷贝数的转化子进行诱导发酵比较，确定出产量最高的双启动子多拷贝转化子，即获得高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组巴斯德毕赤酵母工程菌株。
3.如权利要求2所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于:所述产量最高的双启动子多拷贝转化子是GS115-A3-G2，其中:GSl 15表示巴斯德毕赤酵母基因，A3表示有3个AOX启动子，G2表示有2个GAP启动子。
4.权利要求1所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌在水解菊粉用于生产低聚果糖中的应用。
【文档编号】C12N1/19GK103981112SQ201410215648
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】林建强, 林胜强, 白杨, 林建群 申请人:山东大学
文档序号 :
【 476863 】
技术研发人员：林建强,林胜强,白杨,林建群
技术所有人：山东大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：林建强,林胜强,白杨,林建群
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