结合真菌应激蛋白hsp90的新型抗体分子和核酸的制作方法

2025-04-13 17:20:02 258次浏览

专利名称：：结合真菌应激蛋白hsp90的新型抗体分子和核酸的制作方法结合真菌应激蛋白HSP卯的新型抗体分子和核酸本发明涉及特异地结合真菌应激蛋白hsp卯的新型抗体分子、编码这样的肽的核酸、药物组合物及其用途。在例如WO01/76627或WO05/102386中已经描述了结合真菌应激蛋白hsp90的抗体片段以及它的治疗用途。该抗体片段，也称Mycograb(Efungumab)，是一种融合蛋白，包括由连接肽连接的免疫球蛋白VH和Vi结构域。这种抗体片段也被称为"单链可变片段"(scFv)。Mycograb是以包涵体的形式在E.coli中经过发酵而产生，其中包涵体是从细胞群中提取、重折叠并随后在变性条件下通过层析法的步骤纯化。天然条件下进行的特征研究表明，efungumab蛋白质有形成多聚体或聚合物(术语"多聚体，，和"聚集体"在本文可互换使用)的倾向。这样的聚集体，尤其是高分子量的聚集体，对治疗用途未必是可取的。因此，对于治疗用途来说，可能期望消除或减少高分子量聚集体或者控制聚集，从而使大多数这样的聚集体所包含的单体的数量在一定范围内，例如在10到100个单体之间，例如在11至73或26至57个单体之间。本发明现在提供了改进的结合真菌应激蛋白hsp90的scFv肽，其对于如折叠性质和/或聚集体形成方面具有有利的性质。因此本发明的肽对于治疗用途特别有用。根据本发明的一个方面，提供了scFv肽，其包括由氨基酸间隔物连接的Vh結枸域和Vl結枸域，其中该Vh結枸域包括与SEQIDN0.64的序列具有至少80%同一性的序列，该Vl結枸域包括与SEQIDNO.66的序列具有至少80%同一性的序列，其中该scFv肽包括另外的特征，所述特征选自(a)在VH结构域中对应于选自C28、I29、H68、N8S、(:97及其组合的位置上取代或者缺失氨基酸；(b)在VL结构域中对应于选自V2、V3、F10、F14、A39、N76及其组合的位置上取代或者缺失氨基酸；(c)该氨基酸间隔物包括序列(GGGGS)n,其中n是在4至6之间；(d)该VH结构域还包括N-末端pelB信号序列，其包括SEQIDNO.68的序列或与其至少有80%序列同一性的序列；(e)该VL结构域位于该VH结构域的N-末端结尾；(f)特征U)到(e)的组合。优选该VH结构域包括与SEQ.IDNO.64的序列具有至少卯％、95%、99%或100%同一性的序列。还优选该Vl結枸域包括与SEQ.IDNO.66的序列具有至少90%、95%、99%或100%同一性的序列。应该了解的是，另外的特征的存在无关序列同一性的水平。例如，如果另外的特征是取代在C28位置的氨基酸，那么甚至在VH结构域包含与SEQ.IDNO.64仅有80%序列同一性的序列的实施方案中，此取代仍存在。在VH结构域中氨基酸取代方便地选自C28Y、C28S、I29S、H68R、N85S、C97Y、C97S及其组合。C2sY取代是特别优选的。有利地，在VL结构域中氨基酸取代选自V2I、V3Q、F10S、F14S、A39K、N76S及其组合。优选的，该scFv肽包括的M酸序列选自SEQIDNO.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62，其中Xaa表示除半胱氨酸以外的氨基酸残基，且其中的N-末端蛋氨酸残基可任选地被切除，优选Xaa表示酪氨酸残基。在一个实施方案中Xaa是Tyr(Y)。在另一实施方案中Xaa是Ala(A)、Leu(L)、He(I)、Val(V)、Pro(P)或Met(M);在又一实施方案中Xaa是Phe(F)或Try(W);在另一实施方案中Xaa是GIy(G);在又一实施方案中X是Ser(S)或Thr(T);在又一实施方案中Xaa是GIu(E)或Asp(D);在又一实施方案中Xaa是GIn(Q)或Asn(N);在又一实施案中Xaa是Arg(R)、Lys(K)或His(H)。优选该scFv肽还包括纯化标记，更优选在C末端的6组氨酸残基序列。根据本发明的另一实施方案，提供的scFv肽由这样的M酸序列组成或基本上由这样的^J^酸序列组成，如SEQIDNO.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基酸序列，其中所述的肽可以任选地包括纯化标记例如，His-标记(例如SEQIDNO.10、22或34中所示)。该纯化标记通常不提供分子的治疗效果，因此可以在纯化本发明的scFv片段后即除去。根据本发明的另一方面，提供的scFv肽包括如SEQIDN0.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基断列。在一个实施方案中，提供的scFv肽由这样的M酸序列组成或基本上由这才羊的氨基,列組成，如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基酸序列，其中所述的肽也可以任选地包括纯化标记例如，His-标记(例如，如SEQIDNO.2、4或20中所示)。如容易地被技术人员理解的一样，本发明的肽的第一个Met残基也可以在体内被切除，如果在大肠杆菌中表达，则被大肠杆菌MAP(蛋氨酸氨肽酶)切除。本发明的scFv肽包括由氨基酸间隔物连接的两个结构域(术语"间隔物"和"接头"交替使用)，该氛基酸间隔物例如具有M酸序列(GGGGS)n，其中n是从1到12的整数，例如1、2、3、4或5。其中一个命名为VH的结构域，对应于抗体片段的重链部刺对应例如SEQIDNO.2和SEQIDNO.30中所示M餅列的scFv片段中的2至122氨基酸残基，或在SEQIDNO.32中所示的132至152氨基酸残基)。另一个命名为VL的结构域，对应于抗体片段的轻链部分(对应例如SEQIDNO,2中的138至246氨基酸残基，或SEQIDNO.12中的138-246^J^酸残基，或SEQIDNO.32中的2至110氨基酸残基)。该Vh或Vt结构域可以位于的本发明的scFv肽的N-末端，即该分子可以按如下连接V『接头-VL或Vl-接失-Vh。当在大肠杆菌中表达时，该任选的pelB信号序列使肽亚细胞定位到周质膜，以改善肽的溶解度。在一个实施方案中，提供了scFv片段，其包含SEQIDNO.30或32中所示的M酸序列。在另一实施方案中，提供了scFv肽，其由这样的氨基酸序列组成或基本上由这样的氨基酸序列组成，SEQIDNO.30或32中所示的氨基酸序列，其中该所述的肽也可以任选地包括纯化标记例如，His-标记。一方面，本发明提供了scFv片段，其包括根据本发明的Vh和V^结构域和接头(例如在SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、30、32或34中所示)，其至少有一个M酸在下列的一个或多个位置被取代C29X、I30X、H69X、N86X、C98X、V139X、V140X、F147X、F151X、A176X、N213X，其中X表示除在SEQIDNO.2中所示的以外的氨基酸(编号方式如SEQIDNO.2中所示，且可以容易地确定在其他突变体中相应的M酸位置)。在优选的实施方案中，本发明提供了scFv片段，其至少有以下氨基酸取代中的一个C29Y或C29S、130S、H69R、N86S、C98Y或C98S、V139LV140Q、F147S、F151S、A176K、N213S。应该意识到，涉及这方面的氨基酸的编号方式包括N-末端蛋氨酸残基。在一个实施方案中，提供了scFv片段，其包括SEQIDNO.24、26或28中所示的M酸序列。在另一实施方案中，提供了scFv肽，其由这样的氨基酸序列组成或基本上由这样的^J^酸序列组成，如SEQIDNO.24、26或28中所示的氨基酸序列，其中所述的肽也可以任选地包括纯化才示^己，j:i口His-才示i己。本发明的肽作为治疗剂是有用的。因此，本发明的一个方面中，提供的药物组合物包括根据本发明的scFv肽，例如包括如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的^j^紗列，其中Xaa如上定义，结合可药用的赋形剂、稀释剂或栽体。适当赋形齐寸的详'清载于Remington'sPharmaceuticalSciencesandUSPharmacopoeia,1984，MackPublishingCompany,Easton,PA,USA.。示例性的赋形剂包括药物级(PhEur)尿素和L-精氨酸(PhEur)。例如，本发明的scFv肽的典型制剂是10mg纯scFv肽，150mg药物级(PhEur)尿素和174mgL-精氨酸(PhEur)，在5ml水中重构。可以在剂量为0.1至10mg/kg病人体重的范围内施用本发明的scFv肽或药物组合物。剂量在0.5至5mg/kg体重的范围是优选的，剂量约为lmg/kg是特别优选的。该药物组合物可以口服。本发明的肽可用于治疗真菌感染，例如WO01/76627或WO05/102386中所公开的，其中每一项在此通过引用并入本文。例如，本发明的肽可用于治疗系统性真菌感染，如侵入性念珠菌病或侵入性曲霉菌病或侵入性脑膜炎如剧毒念珠菌属白色念珠菌(Cfl/6/CflWS)、热带念珠菌(CI^/7/Cfl/&)和克柔氏念珠菌(C./^"m;)以及毒性较弱近平滑假丝酵母念珠菌(C./7"f"/m7oWv)和光滑球拟酵母菌(Torulopsisglabrata)。本发明的肽也可用于念珠菌、隐球菌、组织胞浆菌、曲霉菌、球拟酵母、毛霉菌病、芽生菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病生物或痴疾感染的治疗。因此，本发明提供了治疗真菌感染病人的方法，包括对病人施用有效量的本发明的scFv肽，例如包括如SEQIDNO，2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的^j^酸序列，其中Xaa如上定义。该N-末端Met可被/f壬选切除。本发明的肽对组合治疗特别有用。因此，在另一个方面，本发明提供了包含本发明scFv肽和抗真菌剂的组合物或組合的制剂，scFv肽例如包括如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的^J^酸序列(该N-末端Met可祐:任选切除)，其中Xaa如上定义，所述抗真菌剂如多烯抗真菌剂或棘球白素抗真菌剂或唑类抗真菌剂。作为本发明肽的组合搭档的抗真菌剂的例子包括例如两性霉素B、两性霉素B的衍生物，如两性霉素B脂质体、两性霉素B脂质复合物(Abelcet)、两性霉素B胶体分敎系(Amphocil)和两性霉素B英脱利匹特乳剂；制霉菌素；5氟胞嘧啶；卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净、LY303366;唑类如艾沙康唑(isavuconazole)、伏立康峻、伊曲康峻、氟康唑、咪康唑、酮康唑、泊沙康唑、阿尼芬净，米卡芬净，灰黄霉素，特比萘芬。尽管这种组合一般可以是固定的剂量组合，但scFv肽及其组合搭档并不打包成固定剂量组合。本发明的组合制剂在治疗真菌感染时可以同时、分别或相继^f吏用。本发明的肽也可以与一个以上的抗真菌剂结合^f吏用，例如，两性霉素B和5氟胞嘧啶、菌纤维素和两性霉素B、或棘球白素加唑类。在另一实施方案中，本发明提供了一种治疗真菌感染病人的方法，包括对病人施用有效量的本发明的scFv肽和至少一种上文所述的抗真菌剂，该scFv肽包括力口SEQIDN0.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的^J^酸序列(该N-末端Met可被任选切除)，其中Xaa如上定义。优选的组合搭档是两性霉素B或两性霉素B的衍生物、卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净、伏立康唑、伊曲康唑。组合搭档可同时、分别或相继施用。在本发明的一个实施方案中，引起感染的真菌对本发明肽的组合搭档有抵抗力或者有部分抵抗力。本发明的肽还可用于治疗癌症，或涉及TNFa和/或IL-6水平升高的疾病，如自体免疫性疾病或败血症，例如在WO06趣384或WO07/077454(PCT/GB2007/000029)中公开的，其各通过引用并入本文。例如，本发明的肽可用于治疗白血病，如淋巴(淋巴细胞)白血病(CLL)、急性骨髓(成髓细胞)白血病(AML)、急性淋巴(成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性骨髓白血病(CML)、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤；或治疗靼向人类hsp卯的败血病(W007/077454)。因此，本发明提供的治疗患有癌症或涉及TNFa和/或IL-6水平升高的疾病(如自身免疫性疾病、全身炎症反应综合症(SIRS)或败血病)病人的方法，包括对病人施用有效量的本发明的scFv肽，scFv肽例如包括如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基紗列(该N-末端Met可净皮任选切除)，其中Xaa如上定义。在一些实施方案中，该自体免疫性疾病是克罗恩氏病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或系统性红斑狼疮。本发明多肽可用于与抗癌剂的组合治疗。合适的抗癌剂的例子包括阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、赫赛汀、多西紫杉醇、顺铂、伊马替尼(Gleevec⑧)、紫杉醇、阿糖胞苷或羟基脲。因此，本发明提供了包含本发明的scFv肽和抗癌剂的组合物或组合制剂，scFv肽如包括如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基酸序列(该N-末端Met可被任选切除)，其中Xaa如上定义，所述抗癌剂选自阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、赫赛汀、多西紫杉醇、顺铂、伊马替尼、紫杉醇和羟基脲。还提供了治疗癌症病人的方法，包括对有需要的病人施用有效量的本发明的scFv肽和至少一种抗癌剂，scFv肽例如包含如SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的tt酸序列(该N-末端Met可被任选切除)，其中Xaa如上定义，所述抗癌剂选自阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、赫赛汀、多西紫杉醇、顺铂、伊马替尼、紫杉醇和羟基脲。根据本发明的另一方面，提供了改进的编码所述的scFv肽的核酸分子和改进的核酸构建体，其特别适用于这样的scFv肽在例如大肠杆菌中的表达。例如本发明的核酸构建体导致在大肠杆菌中scFv肽表达提高，例如在所表达的scFv肽的同质性和滴度方面体现。优选地，该核酸分子还包括序列(taa)n，其位于编码scFv肽的序列的3，端，其中n为1或2。根据本发明的另一方面，提供了核酸分子，其包括编码VH结构域和Vt结构域的序列，该Vh結枸域包括与SEQIDN0.64具有至少80%的序列同一性的序列，该Vt结构域包括与SEQIDNO.66具有至少80%的序列同一性的序列，以及还包括位于编码VH或VL结构域的序列的3'端的序列(taa)n，其中n为1或2。提供的3，端的多个终止密码子避免了误读事件。在另一个方面，本发明提供了核酸分子，例如DNA或RNA分子，其包括如SEQIDNO.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的核苷酸序列，其中nnn表示编码除半胱氨酸以外的氨基酸的密码子。例如，在一个实施方案中，nnn可以编码酪氨酸例如TAT。在另一个方面，本发明提供的核酸分子包括如SEQIDNO.l、3、5、11、15或19中所示的核苷^f列。如技术人员所知的，可以容易地修饰核^列而不改变所编码的M酸序列。核酸分子基于这样核苷酸序列，其包括如SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的核苷酸序列，具有一个或多个(例如，高达IO、20、50或100个)这样的沉默突变的序列也包含在本发明的范围内。还包含核酸分子，其(i)与SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61有至少80%的同一性，优选地至少有90%、95%、99%或100%的同一性；或(ii)与具有如SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示序列的核酸分子在高度严格的条件下杂交。术语高度严格的条件很容易被技术人员理解，可以指例如在37°C(对14碱基寡核苷酸)、48。C(对17碱基寡核苷酸)、55。C(对20g寡核苷酸)、60。C(对23碱基寡核苷酸)用6倍SSC/0.05。/。焦磷酸钠洗涤。对不同组成的核酸，这种严格的条件的合适的范围在Krause和Aaronson(1991)MethodsinEnzymology，200:546-556有所描述。在一个实施方案中，本发明提供的载体分子包括本发明的核酸分子的核普紗列，例如SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示。优选地，这样的载体分子适合于在如大肠杆菌中表达如SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的核酸分子。适当的表达栽体很容易为技术人员所知。适当的载体的例子包括例如pGEX或pET。另一实施方案提供了包括这样的载体分子的宿主细胞，例如大肠杆菌。在另一实施方案中，提供了生产本发明的scFv肽的方法，scFv肽如包括SEQIDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中所示的氨基酸序列(该N-末端Met可被任选切除)，其中Xaa如上定义，所述方法包括培养已在其中引入表达载体的宿主细胞，该栽体包含在适当的转录调控元件控制下的本发明的核酸分子的核酸序列，核酸序列例如SEQIDNO.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所述，在足以表达该宿主细胞如大肠杆菌中的所述肽的条件下培养宿主细胞，从而引起所述肽的生产；回收由所述细胞产生的肽。两个序列之间的百分比"同一性"，利用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul，StephenF.，ThomasL.Madden,AlejandroA.Schaffer，JinghuiZhang,ZhengZhang,WebbMiller,和David丄Lipman(1997),"GappedBLASTandPSI陽PLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms",NucleicAcidsRes.25:3389-3402)使用默认参数测定。特别地，该BLAST算法可以在因特网上使用互联网网址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/访问。附图简述图1概略图示了野生型MycograbscFv肽和Mycograb突变体序列。编码各自肽的核酸分子的终止密码子也显示在C-末端尾部。图2图示了实施例2的ELISA测定的原理。图3是图表，其中的黑色的条显示用NLS溶解所有研究的突变体后的产量。误差条显示分析了两次的样本的标准偏差。白色的条是所有研究的突变体经NLS重折叠后的质量平衡的图示。突变体按重折叠回收值的渐增排序。图4显示的图表示，5个所选突变体在用尿素和DTT作为增溶剂(A)和用盐酸胍(GuHCl)和DTT作为增溶剂(B)时，重折叠后的回收率。白条当用IB.SOL溶液中的蛋白质的质量用于计算时的回收率(1当量)黑条当用IB.RES溶液中的蛋白质的质量用于计算时的重折叠回收率。图5图表，显示了所有试验的突变体在增溶溶液中添加了4。/。NLS后可见开始澄清所需要的时间(白条)，以及直到观察不到进一步的澄清所需要的时间(黑条)。突变体按照其开始时间的升序排列。图6溶解响应起始的变异性图表，并显示半胱氨酸数、连接元件数以及重链(VH)或轻链(VL)片段是否在N末端。1:突变体Mycl06具有最快的溶解开始，但包含5个半胱氨酸。图7显示突变体MYC135、Myc130、Myc133、Myc119、Myc123野生型和Myc116的REFend样品重叠的色谱图。图8显示突变体MYC134、Myc137、Myc138、Myc106、Myc136、Myc123和Myc139的REFend样品重叠的色语图。图9显示了下列参数的标度估计(scaledestimate)和预测分布图(predictionprofiler):突变体的保留时间对于接头长度、半胱氨酸数量和VH/VL排列的响应。标度估计预测，当该^从中心点(预测分布图X轴上绘制的红色数字)增加到更高水平时，保留时间会变换到什么程度。图10对试验的突变体用接头长度对RP-HPLC(RPC2)中测量的保留时间作图。对比于其他突变体，MYC130的早保留时间突出。图11显示了图7和8中所有REF.END样品的归一化重叠，以估计峰2中的峰面积。图12显示8M尿素+DTT、8M尿素、6M盐酸胍+DTT溶解的MYC119的REF.End样品的RP-HPLC2色i普图重叠，6M盐酸胍用包含20mMTris、2mM半胱氨酸、1%NLS，pH9.0的緩沖液1:50稀释。图13用6M尿素和5mMDTT溶解并随后由1:10稀释重折叠的MYC119的REF.End样品的RPC2色语图。图14用6M尿素溶解并分别由1:10和1:50稀释而重折叠的MYC119的REF.IM和REF.END样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的凝胶图像。1-8泳道非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，9-14泳道还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。R^还原；n-F非还原。图15用6M尿素(黑色)和4。/。NLS(蓝色)溶解后的突变体MYCn9的包涵体样品的RP-HPLC色谱图(RPC2)重叠。图16显示了左侧凝胶突变体MYC118、119、130、133、134、135和137的还原(r)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图像；以及右侧凝胶相同样品的非还原(n-r)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图像。图17显示了左侧凝胶突变体MYC106、123野生型、136、138、139和140的还原(r)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图像；以及右侧凝胶相同样品的非还原(n-r)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图像。图18突变体Myc118、Myc119、Myc130、Myc133和Myc135的REF.End样品的SECHPLC0.5%NLS色i普图的重叠。源自这些突变体的包涵体以实验室规^莫分离。图19突变体Myc134、Myc136、Myc137、Myc138、Myc139、Myc140、Myc106和Myc123野生型的REF.End样品的SECHPLC0.5%NLS色镨图的重叠。源自这些突变体的包涵体在中试工厂分离。图20显示了所有突变体的REF.End样品的测量的MW对理论MW的散点图和线性回归(连续线)。还显示了拟合的95%的置信区间(虛线)。左上的点表示MYC130。虛线内的点是在95%置信区间(CI)内的，因此与野生型没有显著差异。两条虚线下面的点代表具有比预期低的平均MW的突变体，两条虚线上面的点代表测得的平均MW比预期高的突变体。图21显示了经过50mMTris，pH9.0緩冲液UFDF后的Myc119、Myc106-origami、Myc123野生型和Myc137的REF.END样品的SEC-HPLC(制剂)色镨图。每次体积重建后取样品。UFDF处理前的样品(5)，第一次緩冲液交换步骤(2)、第二次緩冲液交换步骤(3)、第三次(4)和最后(5)步骤后。图22显示了所有试验的突变体的REF.IM、REF.3T和REF.END样品的RP-HPLC2色i普图。序列表简述SEQIDNO.1是Mycl23SEQIDNO.2是SEQIDNO.1编码的肽序列SEQIDNO.3是Myl02，Mycograb-6H-TAASEQIDNO.4是SEQIDNO.3编码的肽序列SEQII)NO.5是Mycl01、Mycograb-TAASEQIDNO.6是SEQIDNO.5编码的肽序列SEQIDNO,7是MycC29X-TAA,例如Myl05、MycC29Y-TAASEQIDNO.8是SEQIDNO.7编码的肽序列SEQIDNO.9是MycC29X-6H-TAA，例如Mycl06、MycC29Y-6H-TAA、Mycl13、MycoC29S-6H-TAASEQIDNO.10是SEQIDNO.9编码的肽序列SEQIDNO.11是Mycl07、Myco-4-TAASEQIDNO.12是SEQIDNO.11编码的肽序列SEQIDNO.13是MycoC29X-4-TAA，例如Mycl08、MycoC29Y-4-TAA;Mycl14、MycoC29S-4-TAASEQIDNO.14是SEQIDNO.13编码的肽序列SEQIDNO.15是Mycl09、NMyco-4-TAASEQIDNO.16是SEQIDNO.15编码的肽序列SEQIDNO,17是N-MycoC29X-4-TAA，例如Mycl10、N-MycoC29Y-4-TAASEQIDNO.18是SEQIDNO.17编码的肽序列SEQIDNO.19是Mycl11、N-Myco-6H-TAASEQIDNO.20是SEQIDNO.19编码的肽序列SEQIDNO.21是N-MycoC29X-6H國TAA，例如Mycl12、N-MycoC29Y-6H-TAASEQIDNO.22是SEQIDNO.21编码的肽序列SEQIDNO.23是Mycl15、MycYSSSSEQIDNO.24是SEQIDNO.23编码的肽序列SEQIDNO.25是Mycl16、MycYSIQSSSEQIDNO,26是SEQIDNO.25编码的肽序列SEQIDNO.27是Mycl17、MycSIQKSSEQIDNO.28是SEQIDNO.27编码的肽序列SEQIDNO.29是Mycl18、VH画2Bam-2VLSEQIDNO.30是SEQIDNO.29编码的肽序列SEQIDNO.31是Mycl19、VL-2Bam-2VHSEQIDNO.32是SEQIDNO.31编码的肽序列SEQIDNO.33是Mycl45、MycC98X-6H-TAASEQIDNO.34是SEQIDNO,33编码的肽序列SEQIDNO.35是Mycl29(MycYSRIQSS)SEQIDNO.36是SEQIDNO.35编码的肽序列SEQIDNO.37是Mycl30(MycYSRSIQSSKS)SEQIDNO.38是SEQIDNO.37编码的肽序列SEQIDNO.39是Mycl33SEQIDNO.40是SEQIDNO.39编码的肽序列SEQIDNO.41是Mycl34SEQIDNO.42是SEQIDNO.41编码的肽序列SEQIDNO.43是Mycl35SEQIDNO.44是SEQIDNO.43编码的肽序列SEQIDNO.45是Mycl36SEQIDNO.46是SEQIDNO.45编码的肽序列SEQIDNO.47是Mycl37SEQIDNO.48是SEQIDNO.47编码的肽序列SEQIDNO.49是Mycl38SEQIDNO.50是SEQIDNO.49编码的肽序列SEQIDNO.51是Mycl39SEQIDNO.52是SEQIDNO.51编码的肽序列SEQIDNO.53是Mycl40SEQIDNO.54是SEQIDNO.53编码的肽序列SEQIDNO.55是Mycl41SEQIDNO.56是SEQIDNO.55编码的肽序列SEQIDNO.57是Mycl42SEQIDNO.58是SEQIDNO.57编码的肽序列SEQIDNO.59是Mycl43SEQIDNO.60是SEQIDNO.59编码的肽序列SEQID肌61是Mycl44SEQIDNO.62是SEQIDNO.61编码的肽序列SEQIDNO.63是编码野生型Mycl23scFv肽重链的核苷酸序列。SEQIDNO.64是SEQIDNO.63编码的肽序列SEQIDNO.65是编码野生型Mycl23scFv肽轻链的核苷酸序列。SEQIDNO.66是SEQIDNO.65编码的肽序列SEQIDNO.67是pdB信号序列的核苷酸序列SEQIDNO.68是SEQIDNO.67编码的肽序列。SEQIDNO.69是念珠菌hsp90的表位，SEQIDNO.2的scFv肽(Mycograb)是对于该表位特异的。SEQIDNO.70是在实施例2中用于结合测定的乱序(scrambled)的肽的表位。实验实施例1大肠杆菌宿主细胞用表达栽体转化，并在浸没培养(submersculture)中培养。在适宜的OD600，scFv的表达通过可诱导启动子的抑制或激活所诱导(即tac、trc或T7-lac启动子)。该豫导导致了scFv在宿主细胞中的积累，使得不溶性包涵体产生，其主要是由聚集的scFv形成。经过适当的表达时期后，通过离心收获细胞，并进行破裂。随后通过重量分析方法分离不溶性的包涵体。将SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的DNA序列插入到适合大肠杆菌的表达栽体中(即pET)。蛋白质在大肠杆菌宿主中表达，然后通过亲和色镨法纯化。使用标准分子生物学流程(见例如，Harlow&Lane,同上；Sambrook，J.等，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Sambrook，J.&Russell,D.，2001，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor)。在细胞内表达后，scFv肽以包涵体的形式在大肠杆菌细胞中累积。为了纯化，分离包涵体并通过溶解和重折叠作用提取产物。通过离子交换色谱法和固定金属亲和层析(IMAC)使纯化达到纯度95%以上。实施例2-ELISA活性测定1.概要用ELISA检测MYC123("野生型"Mycograb)和突变Mycograb肽的结合活性，其中使用hsp90的肽表位作为抗原。Myeograb或Mycograb突变体与生物素化肽结合，生物素化肽再结合链霉抗生素涂布的微滴定板。使用乱序的肽作为对照序列。使用缀合了过氧化物酶的抗-His抗体来完成检测，其结合到MYC123蛋白质的His区域。该过氧化物酶与ABTS底物反应产生绿色物质，在405nm测量该绿色物质的吸收。该405nm处的吸收与溶液中的MYC123活性成比例。该活性用参考标准物的6点标准曲线确定，并与该参考物对比以％活性表示。在图2中描述了ELISA的原理，其中链霉抗生素1涂在平板上并与生物素2结合。生物素2再与hsp90肽3结合，该hsp卯肽3位于MYC123scFv肽5的hsp卯结合位点4。该scFv肽5具有His标记6，抗-His-过氧化物酶检测抗体7与His标记6结合。2.方法原理及来源使用的ELISA是一种直接检测方法，其利用生物素化抗原肽(生物素-NKILKVIRKNIVKK:念珠菌hsp卯的表位序列)涂布的链霉抗生素表面微滴定板捕获Mycograb或Mycograb突变体。然后使用缀合辣根过氧化物酶的抗-His标记抗体检测Mycograb或Mycograb突变体的存在。然后将辣根过氧化物酶的底物ABTS加到孔中，存在的Mycograb的浓度与405nm处测量的吸光度成比例。Mycograb或Mycograb突变体才羊品的活性直接由标准曲线确定，该标准曲线是利用先存在的Mycograb药品标准物质产生的。3.材料3.1设备StreptawellHighBind孩￡滴定板是由Roche供应(目录号11989685001)。使用Bio-RadModel680微板读板器进行分析。使用微板管理(MicroplateManager)软件版本5.2.1(Bio-Rad，USA)执行硬件控制。使用微软的Excel进行数据分析。3.2化学药品和试剂3.2.1化学药品除非另有说明，所有化学药品均为分析级。Tris..........................................SigmaT6791牛血清白蛋白.................................SigmaA7030浓盐酸.......................................Sigma32033-1磷酸盐緩冲盐片剂........................SigmaP4417吐温20.......................................SigmaUltraP7949抗-His标记抗体HRP缀合物...............SigmaA7958ABTS..........................................SigmaA3219生物素-NKILKVIRKNIVKK(SEQ.IDNO:69)…Pepceuticals，UK生物素-SFKWGVTTSLSYFPK(SEQ.IDNO:70)...Pepceuticals,UK水、超纯(Milli-Q)水18.2MQ过滤0.22jim孔径。3.2.2试剂封闭緩冲储液l(超纯水中5。/。w/v牛血清白蛋白)牛血清白蛋白(BSA)...........................................2.5g称取2.5gBSA加到50mL的超纯水中。在4。C储存1周。1MpH值7.8的Tris緩冲液Tris....................................121.24g称取121.24gTris溶于950ml超纯水并搅拌。检查pH并逐滴加入浓盐酸调整pH值至7.8。用超纯水加到1升。通过0.22fun的过滤器(Sartorius)过滤并在室温下保存达1个月。样品稀释緩冲液(20mMTris，pH值7.8，0.1%w/vBSA)将lmL的1MTris储液加入48ml超纯水和lmL封闭緩冲储液1。每次实验新制。洗涤緩冲液(PBS+吐温200.1%v/v)在卯0mL超纯水中溶解5片PBS片剂，加入lmL吐温20,搅拌直到片剂溶解并加入超纯水至1000mL。在4。C储存达1周。封闭緩冲储液2(洗涤液+5%w/vBSA)BSA.................................2.5g称取2.5gBSA并溶解在50mL洗涤緩冲液中。在4。C储存1周。肽稀释緩冲液(PBS+0.1Q/qv/v吐温20+0.1%w/vBSA)将lmL封闭緩冲储备2加到49mL洗涤緩冲液中。每次实验新鲜制备。抗原肽溶液生物素-NKILKVIRKNIVKK肽..............................10mg。通过称取10mg肽并将其溶解在5ml超纯水中，制备2mg/ml的常规合成的抗原肽溶液。将50-100^1的小份分装到1.5mlEppendorf管中并冷冻保存于-80。C达一年。抗原肽操作溶液(4fig/mL肽，处于肽稀释緩冲液中)将25nL抗原肽溶液(2mg/mL)添加到12.475mL肽稀释緩冲液中，得到4照/mL的溶液。每次实验新鲜制备。3.2.3样品制备对照力口在5ml超纯水中，重悬1x10mgMycograb对照品批次(BN270603)轻轻混合，以确保所有在小瓶中的粉末均掺入并溶解。在13，000rpm离心5分钟，以除去任何颗粒物。然后根据标准UV蛋白质浓度方法测定该溶液的蛋白质浓度。试验品在5ml超纯7jC中重悬1x10mgMycograb或Mycograb突变体试验材料，并以与对照品同样的方式处理。校准曲线标准物在样品稀释緩沖液中稀释对照品材料，得到5mL5照/mL的最高浓度样品。然后用此溶液来产生2倍连续稀释样品，每个样品的最终体积是2mL，浓度范围是5-0.156jig/mL。4,操作1.从冷冻库取出一份2mg/ml的抗原肽储液，并用含0.r/。(w/v)BSA和0.1。/。(v/v)吐温20的PBS緩冲液以1:500(25^1肽于12.5ml緩冲液中)稀释，来产生4jig/ml肽的操作溶液。96孔的高结合Str印taWell板(Roche)的B-H行涂布100nl处于0.1%(w/v)BSAPBS-0.1%(v/v)吐温20中的4ng/ml的生物素-NKILKVIRKNIVKK肽。在A4亍所有孔的每孔中加入100^1的0.1%(w/v)BSAPBS-0,1%(v/v)吐温20，然后将该板在4。C过夜储存。2.然后在ThermoWellWashAC洗板机上，用200^1PBS0.1%(v/v)吐温20緩冲液洗涤该板孔3x30秒。3.上样前制备Mycograb和Mycograb突变体样品，通过将重悬的Mycograb瓶装储液用20mMTris緩沖液pH7.8、0.1%(w/v)BSA稀释至5pg/ml制备。然后从该5ng/ml起始溶液制备Mycograb⑧样品，通过用20mMTris緩冲液pH7.8、0.1%(w/v)BSA将其连续2倍稀释至0.15625ng/ml。所有的每次稀释取决于该实验所需的数量，在1.5mlEppendorf管(VWR目录号211-2139)或7mlBijoux容器(VWR目录号215-0328)中进行。然后将每个稀释样品的100nl上样到平板上，一式三份。包含100nl20mMTrispH7.8、0.1%(w/v)BSA的空白孔的对照组也包括在H行中。4.将该板在室温放1小时，然后如步骤2中所述用PBS-0.1%(v/v)吐温20洗涤孑L3次。5.将100nl小鼠单克隆抗-HisHRP缀合物(SigmaA7058)上样至各孔，浓度为1:2000，处于0.1%(w/v)BSAPBS-0.1%(v/v)吐温20中，并在室温;故置1小时。6.然后按如上所述洗涤孔，通过加入lOOjilABTS⑧试剂检测结合的Mycograb⑧。当二次校准曲线中最高浓度样品的吸光度达1.3AU时取得读数，在405nm处读取比色显色。Mycograb⑧浓度与A405nm处的吸收成比例。7.将该参考物A405nm的吸光度结果转移到Excel表格中，用参考样品A405nm减去空白后的值对于Mycograb⑧的浓度(ng/ml)作六点二次校准函数y=a+bx+cx2，其相关系数^0.99。如果观察到"钩状"效应(hookeffect)存在，则将最高浓度点从图中除去，得到5-点校准曲线。只要每一式三份的测量值中的异常值不超过一个，则在一些情况下每板有两个孔异常值(目测)从数据分析中除去。使用非线性回归分析计算百分比活性，以使用适当的吸光度方法计算样品的表观浓度。在研究中获得的ELISA结果列于表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>样品1和3-6是包涵体预纯化、重折叠并移除洗涂剂NLS(通过Dowex层析法或透析过滤)后获得的处理过程中间体(并非最终的药物物质)，。样品2是Biomeva/Thymoorgan生产的原始野生型药物产品，并在临床试验第III期(PhaseIIItrial)中使用。原始药物产品的规格为参考标准的75-125%。所有样品被评定为有活性的(结合)。实施例3-新型隐球菌(Oy/;似co"附w^/^附a附)最低抑菌浓度的测定概述在最低抑菌浓度(MIC)测定中，利用新型隐球菌作为模型生物，测定MYC123的抗真菌活性。这种分析测量抗真菌活性并可以模拟MYC123在临床环境中的作用。MYC123的MIC是根据美国临床实验室标准化文件(theNationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandardsdocument)M27-A2(2002)利用微量肉汤稀释法测定。简言之向RPMI培养基接种103CFU/ml新型隐球菌。将浓度递减的MYC123加到培养基中(1024jig/ml、512jig/ml、256照/ml...)。将MIC板块在37。C孵育72小时。终点确定为产生光学澄清的孑L(MIC-O)的浓度和导致混浊度相对于生长对照显著降低(S50%生长抑制，MIC-2)的浓度。方法测定前的制备安全橱SAB板接种新型隐球菌并在35。C培养48-72小时。该板用石蜡封口膜密封。工作台制备RPMI。按照NCCLS方法学(M27-A2)制备抗真菌剂-处于RPMI生长培养基中，总共ll个浓度。浓度是单个MIC所需终浓度的2倍。MIC板在一个U型96孔板中，将待测试的IO(HU的最高药物浓度(2倍所需浓度)加到A和B行的孔1中(一式两份进行测定)。将此步骤在板上按列以逐减的浓度进行重复，例如下一个浓度A+B行的孔2，下一个浓度A+B行的孔3，孔12中只包含生长培养基。安全橱接种物制备-直接菌落悬液。新型隐球菌的直接菌落悬液来自48-72小时龄的板，于RMPI培养基中制成。将其调整到0.5MacFarlands标准(约lxl0、5xl06cfu/ml)。制备1:50的稀释液。进一步制备1:20稀释液(约Ixl03-5xl03cfu/ml，2倍接种物所需)。安全橱平板接种。该板从孔12至孔1操作。这避免了药物移行。用移液管向每个孔中加100nl接种物悬浮液(最终接种物(0.5xl03-2.^103cfu/ml)。用石蜡封口膜密封板。将MIC板在37。C孵育72小时。为了检查接种物，将接种物悬液连续稀释，并将10pl稀释液涂至SAB板上，在37。C孵育72小时。读取结果使用镜测读数；增长与无药物对照(孔12)的增长相比较，增长值如下0-光学上澄清1-轻孩史混浊2-生长显著降低(约50%)3-混浊度稍有减少4-混浊度不减少研究中得到的MIC结果如表2所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>样品1和3-6是包涵体预纯化、重折叠并移除洗涤剂NLS(通过Dowex层析法或透析过滤)后获得的处理过程中间体(并非最终的药物物质)，。样品2是Biomeva/Thymoorgan生产的原始野生型药物产品，并在临床试验第III期中使用。将获得的样本的MIC结果与相应的緩冲液获得的结果进行对比。除了样品3之外，所有样品相对于参考070602也视为有活性的。样品3和緩冲液6得到了相同的结果，表明该不含MYC123的緩冲液对试验生物是有毒的。样品1和4-6的值与Tris緩沖液的值差距很大，表明了数据的可靠性提高。实施例4概述该Mycograb突变体的目的是获得与野生型Mycograb相比具有改进的结构特性的突变体scFv肽。人们相信，通过点突变，特别是由酪氨酸取代游离的半胱氨酸，应可减少下游加工过程中的聚集和不正确的二硫键的形成。人们还相信，交换重链片段和轻链片段的定位，以及移除His-标记对Mycograb分子天然3D结构的形成是有益的。克隆后，在发酵前对构建体进行测序。扩大发酵的规3莫，从而为包涵体(IB)的分离和进一步的下游加工递送足够的材料。到重折叠结束步骤，根据修改以适合(此研究)的Biomeva方法纯化突变体的表达构建体。以实施例5至12z^布的方式对一些突变Mycograb肽的物理参数进行测试。所测试的突变体及其突变的概述在表3中给出。研究中包含了野生型以作对比。表3:12个所研究的Mycograb突变体和野生型(mycl23)的名称及结构特性<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>现在描述试验测定中所使用的方法包涵体(IB)的分离由突变体Myc118、119、130、133和Myc135的摇瓶培养物于LVA(Laborversuchsanstalt)中获得4L发酵液，发酵液用高压匀浆器(LAB40-15RBF1)在RPP4中分裂，于700巴进行两个循环，每个15分钟。用瓶离心，于4。C在10000rpm离心20分钟，从细胞碎片中分离试验量的包涵体。用实验室用水(WFL)洗涤包涵体两次，随后在WFL中制备20%(w/v)悬浮液。分装悬浮液，储存在-20。C。因为这些突变体的发酵是在生物反应器中以30升的规模进行的，在RPP4中从突变体Myc134、137、138、106、136、139、140和Myc123(wt)中分离出中试^!^莫的包涵体。用碟片离心机(discstackcentrifuge)从细胞碎片中分离包涵体。在WFL中制备20。/Q(w/v)悬浮液。分装悬浮液，储存在-20。C。用NLS溶解(根据修改以适合的Biomeva方法)。通过用WFL将20。/。包涵体悬浮液稀释至蛋白质浓度为8mg/ml，然后用100mMTris碱、4%NLS、pH9.0緩冲液以l:2稀释，以使20D/。包涵体悬浮液溶解。在室温下在烧杯中搅拌溶液直至澄清，但至少30分钟。纪录直至开始澄清和澄清结束的时间。使用尿素、盐酸胍、DTT的备选溶解方案。该备选溶解方案是用20mMTris8M尿素+/-5mMDTT或者20mMTris、6M盐酸胍+/-5mMDTT，二者都在pH9.0，以1:10稀释各体积的20%包涵体悬浮液。产生的尿素和盐酸胍的浓度分别是7.2M和5.2M，取决于包涵体悬浮溶液的体积。溶解的包涵体的重折叠用NLS重折叠。用50mMTris碱緩沖液以1:4稀释溶解的溶液进行重折叠。NLS的终浓度为0.5%。加入50nMCuCl2以起始重折叠。在加入CuCl2前和之后，还有加入CuCl2后大约24、48、72和96小时取^f羊品并立即进行RPC2分析。用尿素、盐酸胍溶解后的重折叠。在用8M尿素或6M盐酸胍+/-01^溶解后，Mycograb溶液用包含20mMTris碱、1%NLS和2mM胱氨酸、pH9.0的緩沖液以1:50稀释进行重折叠。对于一些突变体，也在用尿素溶解后，用含有20mMTris碱、0.5ML-精氨酸和2mM胱氨酸、pH9.0的緩沖液以1:10稀释Mycograb溶液。分别在4。C搅拌重折叠溶液96小时或者在室温搅拌重折叠溶液24小时。重折叠动力学记录突变体Myc119的重折叠动力学以确定所需的重折叠时间。如上所述溶解Myc119的20%的包涵体悬浮液样品。如上所述进行重折叠，但在各时间间隔提取样本，用RPC2分析。通过UF/DF从重折叠溶液中移除NLS。如上所述溶解和重折叠突变体Myc119、Myc137、Myc106和Myc123(wt)。重4斤叠后，用Amicon搅拌装置(stircell)以10kDa分子量的截断值，进行REF.END溶液的緩沖液更换。每经过一个更新体积(turnover)，即用反相高效液相色i瞽法(RP-HPLC)测定NLS的浓度。50mlREF.END溶液,皮浓缩至25ml，然后再次用透析过滤緩沖液补至50ml。这一程序进行了4次。用运转制剂緩冲液(formulationbuffer)的SEC-HPLC(体积排阻色谱)来测量移除NLS后的聚集趋势。十二烷基琉酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPage)分析使用NuPAGE4-12BisTris凝胶和MOPS作为跑胶緩冲液进行SDSPage。在200伏，跑胶时间为65分钟。每个泳道应用0,2-0.4^ig质量的Mycograb。电泳后凝胶用银染色。对于还原SDSPage，在样品中加入100mMDDT。结果用表4所列的分析方法在下游过程的不同阶段分析突变体的表达构建体。表4.过程中间体的代码和描述以及各自的分析测定法代码中间体描述L分析方法旧.RES旧's重悬液(20。/。w/v)RPC1旧.SOL溶解的旧'sRPC1,RPC2REF.IM加入CuCI2之前的重折叠中间体RPC1,RPC2REF.END重折叠溶液，终点RPC1,RPC2,SEC0,5%NLS,SDSPAGE还原/非还原，肽图，变性SEC表5给出了表4所列的用于评价突变体的分析方法的描述。包括描述具体方法特异性的注释。表5:分析方法，用于评价突变体样本的分析的各自反应和测量单位(UoM)。分析方法响应测量单位注释RPC1蛋白总量mg/ml此测定法对于用SDS、DTT和尿素'溶解的Mycograb才羊品并不是特异的。RPCII色谱[min仅可通过色i普重叠评估此测定法。"单体峰"的移动表示重折叠SEC0.5%NLS平均分子量kDa对于含0.5%NLS的样品，最大值的RT与MW相关。宽洗脱峰从43-900kDaSDSPage，还原单体/二聚体条带;杂质含量条带非共价聚集体通过还原溶解；与非还原胶相比，可进行聚集体含量的半定量评估SDSPage，非还原单体和聚集体条带条带肽图二硫键无信号，信号弱、强和非常强检测肽的能力取决于测量装置的灵敏度SEC制剂平均分子量kDa对于处于与制剂緩冲液相似的基质中的样品，最大值的RT与MW相关。RPCNLSNLS浓度mg/ml在以下的实施例5至12中，总结和讨论了对所研究的突变体各个测定的进一步详细资料。实施例5-溶解和重折叠后的质量平衡-结果RPC1滴定测定用滴定分析测定溶解和重折叠之前和之后包涵体的蛋白质浓度。由于这一分析检测样品中存在的所有可溶性蛋白质，质量平衡应得到100%。溶解的质量平衡用等式1计算。0/"^，'"".'旧.SOL等式l其中mgRPC1IB.SOL是包涵体溶解溶液中蛋白质的质量，通过RPC1方法的浓度测量和IBSOL溶液体积计算出来。mgrpC1IB.RES是20%包涵体悬浮液中的质量，是由RPC1方法的浓度测量和DI中分离的包涵体重悬后的溶液体积计算出来的。利用等式2计算重折叠的质量平衡，并以％回收率表示。在3.3.1和3.3.2中分别描述了用4%NLS、8M尿素+/-5mMDTT或者6M盐酸胍+/-5mMDTT溶解的包涵体的稀释和重折叠。。/。Ref=，^^^等式2呵,",门旧.sol其中mgrpciRef.END是根据用RP-HPLC在重折叠溶液中测量得到的浓度，乘以重折叠溶液的体积，得到的蛋白质的质量。mgRPC1IB.SOL是包涵体溶解物(solubmsate)中的发现的蛋白质的质量，％REF是重折叠后的回收率。等式1和2计算出的所有突变体在用4%NLS溶解以及随后的重折叠之后的质量平衡如图3所示。原始数据可以在表6和7中找到。表6显示了所有测试的突变体的IBRES悬浮液用NLS溶解后的回收和重折叠后的回收，由RPCI分析方法算得。还显示了通过RPCl分析方法测定的IB-RES溶液中的蛋白质浓度和重折叠溶液中的蛋白质浓度。表7显示了由RPCI测定的用尿素(SOL:尿素)和盐酸胍(SOL:盐酸胍)溶解后的IB—RES、IB—SOL和REF.END样品的蛋白质浓度。重折叠时间是4。C下96小时。IB—RES和IB—SOL的稀释因子分别是500和50,以产生REF.END溶液。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>12个所研究突变体中10个的溶解质量平衡超过100%。这可能是由于，包涵体悬浮液的是原液类样品，且最终，取样品的时候包涵体没有彻底溶解，产生不均匀的溶液，从而低估了总的蛋白质浓度。数据的变异性高，对6个突变体分析两次的相对标准偏差范围从2.6%(Mycl38)到42.9%(Myc133)。重折叠后的回收率°/。在72%(Myc138)和99%(Myc134)之间。预期回收率为100%(类似溶解后回收)。重折叠后回收率均低于100%,且不及溶解后的回收率分軟。这表明，在IB.SOL和REF.end样品中对蛋白质浓度的估计比IB.RES样品中的准确。然而，回收率的计算主要作为溶解和重折叠试验的对照。当用8M尿素和6M盐酸胍作为溶剂时，与溶解溶液IB.SOL和包涵体悬浮液IB.RES相关的重折叠产量如图4所示。回收从44%到230%的变化反映了蛋白质浓度测量的问题，特别是在IB.SOL和IB.RES样品中，可能由于取样之前均质不充分。尽管平均高出了1.2倍，尿素溶解后在REF，END样品中的浓度可与盐酸胍溶解后在REF.END样品中的浓度相较(见表6和7)。因此稀释是一致的。实施例6-溶解时间研究了所有的突变体用NLS溶解的时间。记录溶液开始变清的时间和直到不再可以观察到进一步澄清的时间，在图5中说明。相对于使用2°/。的NLS，用尿素+ADTT和盐酸胍+Z-DTT的溶解要快2-3倍。我们发现了半胱氨酸的数量和开始澄清所需的时间之间的关联。除了突变体134(5个半胱氨酸)，有4个半胱氨酸残基的突变体溶解速度快于有5个半胱氨酸残基的突变体。图6显示了变异性图，其中澄清开始(时间)分钟1按3个类别作图N末端的重链或轻链片段的排列，接头元件数量和半胱氨酸残基数量。除了在图6中用1表示的Mycl34，与有5个半胱氨酸的类别中的数据点相比，有4个半胱氨酸的类别中的数据点散布在更早的溶解起始时间周围。回归模型(不包括Myc134时，R2=0.72)预测，对于有4个而非5个半胱氨酸的Mycograb构建体，溶解开始(时间)会从20分钟减少至11.3分钟(模型未显示)。实施例7-RPC2-NLS重折叠MycograbREF.END样品根据Biomeva修改以适合的方法(例4中描述)的溶解和重折叠，突变体由RPC2分析。图7和图8中显示了，包括野生型(MYC123)的所有被研究的突变体REF.END样品的重叠。早些时候在DSP-DEV1实验室篩选突变体Myc116，并为了对比而包括在重叠中。在图7中显示了以实验规;f莫分离的包涵体产生的REF.END样品的色谱图，图8中显示了在中试工厂中以较大规模分离的包涵体产生的REF.END样品的色镨图。于以下方面比较洗脱镨1.保留时间峰l，反映了疏水性2.峰l形状，反映了二聚体的存在和当峰尖锐时单体的均一性3.单体/二聚体峰(峰1)与聚集体/杂质峰(峰2)的面积比，反映聚集体/杂质含量保留时间峰l，反映了疏水性表8中列出了试验的突变体的单体/二聚体峰的保留时间表8:试验的突变体在RPC2中峰l的保留时间f分钟j和分子特性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>保留时间随分子构建体而大有不同。保留时间(反映疏水性)没有像预期那样有随着接头长度而增加的趋势。一个连接元件由四个甘氨酸和一个丝氨酸残基组成。与亲水性的丝氨酸不同，甘氨酸是疏水的。然而，由RPC2中测量的保留时间来看，接头中包含的多4倍的甘氨酸似乎没有显著增加疏水性。Myc130的保留时间比其余的突变体短。有10个M酸被性质更亲水(5个丝氨酸)的氨基酸所代替，从而减少分子的疏水性，并因此导致较早的保留时间。统计分析中去除这个数据点，产生的模型显示，当Vl定位在N-末端时相对于其定位于C-末端时，保留时间有显著性差异。当Vl元件定位在N-末端时相对于其定位于C-末端时保留时间增加0.41分钟。图9显示了，以半胱氨酸数量、接头长度和链片段定位作为因子，保留时间作为响应的模型的标度估计和预测分布图。请注意，Mycl30的保留时间从才莫型中排除。图10中显示了保留时间对接头长度作的图，其表明这一构建体的保留时间比其它突变体低，因为点突变导致更多的亲水性质，如上所述。峰l形状假定没有或者仅有很少的肩部的尖锐的峰1反映了单体的Mycograb的均一性。通过所有突变体REF.End样品的RPC2色谱图重叠评估峰形，并确定突变体Myc137、Myc138和Myc139的最尖峰。峰1比野生型Myc123尖锐且峰1和2几乎基线分离。这可能表示这些构建体表达的单体/二聚体蛋白质比野生型更均一。单体/二聚体峰的面积比对于Myc116和MYC123野生型，与单体/二聚体相关的杂质/聚集体含量最低，如图7所示(Myc123野生型)。然而，3个月前另一个实验室进行了这两个样品的分析，且注意到峰2随着时间增加。与所检测的突变体的REF.End样品同月制备和分析了Myc123的REF.End样品的色谱图如图8中所示。图7中所示的MYC123的色谱图与图8中的所示的对比，得到的结论是，样品制备和分析方法不是可准确重复的。单体/二聚体峰与聚集体峰的面积比，是由将峰l归一化至同样的最大峰值测定。归一化后的峰2的峰面积利用可视面积估计根据其大小升序排列。归一化后的概况如图11所示。可以确立以下顺序Myc116、Myc139、Myc136<Myc119、Myc12、Mycl40<Mycl37、Myc135、Mycl38<Mycl06<Mycl30<Myc134<Mycl18<Mycl33在中试工厂对突变体Myc106、134、136-139的包涵体产生的REF.End样品的RPC2色谱图进行处理，并显示比试验台规模分离的突变体Myc118-135的包涵体的杂质/聚集体峰(参见图8)低。实施例8RPC2尿素/盐酸胍重折叠突变体Mycl18、119、130和Myc133溶解于7.6M尿素+/-DTT和5.6M盐酸胍+ADTT并通过用重折叠緩冲液稀释起始重折叠。并非所有REF.End样品均在RPC2中显示单体/二聚体峰(峰1)。假设是聚集体和杂质的巨峰2占优势。图12给出了突变体Myc119的重折叠终止样品的典型RPHPLC色诿。该样品的制备如实施例4所述。预计单体约在10.5分钟洗脱。没有鉴定较早的洗脱峰，并且使用0.5%NLS的重折叠中没有发现这样的峰。该巨峰2表示强聚集。所有尿素/盐酸胍溶解后REF.End样品得到类似的洗脱镨。当用包含20mMTris碱、0.5ML-精氨酸和2mM胱氨酸、pH9.0的緩冲液通过1:10稀释而重折叠时，得到类似的洗脱谱。典型的色谱图如图13所示。该强聚集倾向被非还原条件下的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，对REF.End样品发现了巨大且浓的高分子量成片条带，尿素溶解后没有可见的单体条带。当还原该样品后，该成片条带随后消失了，并出现单体Mycograb带。在图14中显示了，尿素溶解后还原和非还原REF.End样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。泳道4-7显示在非还原条件下的2个不同稀释的MYC119的REF.IM和REF.End样品。泳道10-13显示还原条件下的相同样品。当样品被还原，且单体和二聚体条带变得清晰可见，聚集体成片条带消失。重折叠溶液中存在的低浓度的尿素和盐酸胍(尿素在1:50稀释的情况下0.14M,1:10稀释的情况下0.72M;盐酸胍在1:50稀释的情况下是0.11M，1:10稀释的情况下0.56M)不能阻止蛋白质的聚集。如图12所示，使用DTT似乎对聚集没有显著影响，因为RP-HPLC色谱图(RPC2)在有DTT和没有DTT时看起来类似。与REF.End样品相反，用尿素溶解的IB.SOL样品的RPC2色谱图，在峰形方面与溶解于2%NLS中的IB.SOL样品可比较。图15显示了HPLC色i普重叠。当用非还原1B.SOL样品的SDS-凝胶电泳分析，样品用尿素溶解比IB.SOL样品用2%NLS溶解的情况，显示较强的HMW(高分子量)条带。这显示在图14泳道3中，样品用尿素溶解，泳道8中，样品用2%NLS溶解。可以得出结论，RP-HPLC中的峰2没有给出有关聚集体含量的指示，因为IB.SOL在尿素中的色语图峰2的重叠甚至比在NLS中小。随后的重折叠并没有产生单体峰，但蛋白质完全聚集。实施例9-还原和非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行还原和非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，以测定在REF.End样品中的杂质和聚集体含量。与非还原SDS聚丙烯酰胺皿电泳相比，还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中，Mycograb种群以单体和二聚体的条带出现，样品中宿主细胞杂质成分可与聚集体种群区分开。非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示Mycograb单体、二聚体和聚集体。将非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色凝胶与还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析对比，可以半定量地评价聚集体种群数量。图16和图17中显示了所有试验的突变体的REF.END样品的还原和非还原SDS聚丙晞酰胺凝胶电泳的凝胶。图16中左侧的M^显示源自突变体MYC118、119、130、133、134、135、137的REF.End样品的还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在30kDa处的条带是单体Mycograb且它在所有样品中是占优势的。根据单体条带的迁移，在突变体MYC134中表达的Mycograb，似乎比其他在凝胶上分析的突变体具有更高的分子量。对于MYC135发现了相同情况，但程度较小。根据表9，MYC134在图16所示的突变体中具有最高的理论分子量，随后是MYC135。-在非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中，聚集体种群以及二聚体都是可见的。在13泳道(MYC134)及15泳道(MYC137)中的HMW条带比在其他泳道中的弱。这就表明了聚集体种群含量较低，然而，单体条带更加微弱。如图16所示，除了Myc133以外，所有突变体均可以观察到相互比较下迁移时间和强度不同的双条带。鉴定这些条带几乎是不可能的，但假定这是具有类似天然结构的Mycograb单体。图17显示了源自突变体MYC106、136、138、139、140和野生型MYC123的REF.End样品的还原和非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。根据单体条带的不同迁移可以确定不同构建体的MW差异。在5和7泳道的条带比在2、3、6和4泳道的条带出现在稍低的MW，此现象与表9中列出的理论MW—致。上样至凝胶的蛋白质的质量是不一致的；单体条带的强度不同，因为REF.End样品中的蛋白质浓度的测定不够准确。因此，杂质含量的半定量分析是不可能的。然而，Myc106的REF.end样品中的较高的杂质含量是明显的，因为单体条带的稠度与Mycl40的一个条带可比较，但其他条带的强度高得多。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，Myc106。rigami的REF.End样品含有更多HCP和与产物相关的杂质。然而，这并未由RPC2分析方法证实，该方法中的峰2的面积与其他突变体在相同范围。实施例10-SEC0.5%NLS:测定REF.END样品中Mycograb种群的分子量所有按照修改以适合的Biomeva方法(见实施例4)制备的REF.END样品均用SEC-HPLC在0.5%NLS中分析，并测定平均分子量。在图18和图19中显示了SEC色谱图的重叠。平均分子质量范围在从48.6kDa到65.8kDa间。峰的宽度反映了样品中种群的异质性。虽然在REF.End样品中约80%的产物是单体，但是还存在二聚体和更高MW的种群以及非产物相关的杂质，造成宽的洗脱峰。在图18中，与其他所研究的样品进行比较，Mycl30的洗脱谱因为前部增加而突出。这可能是由于，构建体的性质(更亲水)造成的样品中增加的异质性，或由于偶然不同的样品处理。同时制备图18中所示的样品，在分析之前4'C储存5天。同时制备图19中所示的样品，在分析之前4。C过夜。样品在4'C似乎是稳定的，因为构建体的MW在相似的范围内。Myc130的前置可能是由于对比于其他研究样品，其聚集体种群数量更多。不过，在对应的RPC2色谱图中的峰2并非显著的大，但是已经观察到，由SEC0.5%NLS测定的增加的MW和RPC2测定的峰2大的峰面积之间，仅在有些时候相关。此外，Myc130的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳没有指示样品杂质含量更高和异质性增加。因为所有样品是在同一天进行分析的，可以排除在SEC中其它导致前置的因素，如柱超栽和分析时温度升高。Myc130在RPC2中保留时间非常早。假设在REF.End样品中平均MW随二聚体、聚集体和杂质数量的增加而增加。由于不同的接头长度和其它突变，计算出的在不同突变体中表达的单体Mycograb的MW在26至27kDa之间。表9中给出了理论MW(从氨基酸计算出的)、由SEC测定的REF.End样品的MW、#^酸数量、接头长度和半胱氨酸数量的列表。表9:所有测试突变体REF.End样品的SEC-HPLC0.5%NLS结果。突变体根据其理论分子量排列。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>用理论MW对由SEC测定的MW作图，并在排除Myc130数据点时,发现相关系数0.77的线性关系。图20中，突变体Myc106、Myc138和Myc135在较低的虚线的右侧以点表示，具有比野生型低的平均MW。突变体Myc133、Myc136和Mycl39在较高的虚线的左側以点代表，具有比野生型高的平均MW。然而，必须考虑到测定法的差异性。此外，从图19可以看出，对于一些样品，注入的蛋白质的质量并不总是与峰面积相同。有4个半胱氨酸的突变体的共价聚集体的形成应比有5个半胱氨酸的Mycograb少，因为有4个半胱氨酸的突变体在形成分子间的二硫键后，没有可用的游离半胱氨酸。分子间的共价聚集体是在重折叠过程中形成的，甚至只有4个半胱氨酸的突变体也可形成，但其数量很可能比有5个半胱氨酸的突变体低。实施例11-SEC制剂通过UF/DF从重折叠溶液中移除NLS以测量聚集倾向为了评价Mycograb突变体的聚集倾向，利用搅拌器通过超滤/透析过滤从REF.End溶液以平均为5的因子降低NLS浓度。透析过滤时用掉的总的緩冲液体积除以存留物体积得到透析因子(diafactor)，为2.5。此试验的原理是研究当增溶剂NLS浓度低至不能再阻止聚集时，突变体的聚集趋势。假定可以用SEC-HPLC制剂评估聚集体的形成。以包含0.5M尿素緩冲液、但没有NLS的洗脱緩冲液抑制聚集。利用分子量的增加作为聚集趋势的量度，并使突变体间可以进行比较。第一组实验中选择突变体Myc137、Myc106、Myc119和野生型Mycl23。表10显示了突变体MYC119、137、106和MYC123的REF.End样品在UFDF之前和之后，通过运转制剂緩冲液的SEC-HPLC测定的以kDa为单位的分子量(MW),和由RP-HPLC测定的NLS(%)浓度。用UFDF前(#2)样品中的NLS浓度除以UFDF后(#3)的NLS浓度计算NLS减少因数。由各个突变体的REF.END样品(#1)的MW和UFDF后(#3)MW计算基于SECHPLC0.5%NLS的MW增加％。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>*分子量通过在运转緩冲液中包含0.5%NLS的分析性SECHPLC方法测定(SECHPLC0.5%NLS)。**表9中的数据。由SECHPLC(运转制剂緩冲液)测定的UFDF前的样品的表观高分子量是由于在分析中蛋白质的聚集所造成。在UFDF之前的样品仍然含有0.5%的NLS。当样品通过柱迁移时，NLS比蛋白质迟緩得更严重，并因此发生聚集。因此，这种分析方法不适合测定含有NLS的样品的分子量。为了测定在REF.End样品中的Mycograb分子量，使用运转緩冲液含0.5%NLS的SECHPLC。依上述联系表10计算REF.End样品中通过UFDF移除NLS后MW的增加。值显示在表10的第6行。MYC123显示MW的最小增长，而MYC119具有最强的增长，为400%。基于这些数据，MYC123的聚集趋势比MYC119低。但是，必须考虑到分析性SECHPLC可能对蛋白质结构和聚集体的形成产生影响。此外，MW的增加是从两个不同的分析方法获得的数据计算出的，且不能评估当用两种不同的方法测定时，样品的MW是否相似。在表11中，突变体根据移除NLS后MW的增加和其突变进行排列。必须指出，两个具有3x连接元件的突变体，与具有4x连接元件的突变体相比，具有显著地较低的MW。/。增加。表11:4个所研究的突变体通过UFDF移除NLS后分子量的增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>图21显示了从样品UFDF前和每一次体积重建后获得的SECHPLC色i普图的重叠。该洗脱峰的形状并没有随NLS浓度减少而显著地改变。因此，样品的MW也随NLS减少而保持不变。这可能表示表面活性剂的浓度存在一个界限，在该界限下起始聚集但没有进一步进行。然而，分析方法对样品MW的影响尚为未知，并可能是所有样品具有相似的MW的原因。5次体积重建后，NLS浓度平均(n=5)下降至浓度为0.124%，相应于2.5倍的透析体积(diavolume)。理论上，对于NLS保留R-0，计算出的剩余NLS浓度应该是0.020%。等式3用于计算理论上的剩余NLS浓度C,=^x(e('"'W—l)等式3其中c一她,是存留物中NLS的浓度，c/^是进料溶液(feedsolution)中NLS的浓度。R是保留，即被膜保留的溶质的分数。VCF是体积浓度系数，N是透析体积(diavolume)，这是用过滤操作中引入的总的緩冲液体积除以存留物体积。理论的和测量的存留物中的NLS浓度之间的差异表示膜保留的NLS大于0。这可能是由于NLS和蛋白质、膜和/或其它成分之间的相互作用。变形的能力也可能导致不需要的保留。实施例12-肽图分析用肽图分析所有突变体REF.End样品的二硫键。分析前样品被碘乙酰胺烷基化，胰蛋白酶消化，并进行液相色谱-质谦分析(LC-MS)。用质谱分析识别单肽紫外峰。尽可能地半定量测定具有游离巯基S-S键、具有正确或者不正确形成的S-S键、及二聚体肽。具有5个半胱氨酸的正确折叠构建体在Cys23和Cys97之间形成二硫键，Cys23和Cys97各自对应于T3和T9。T3-T9键位于轻链。另外的二硫键是在重链上在Cys159和Cys224之间，对应于T12和T17。第五个半胱氨酸位于Cys28并对应于T4肽。具有4个半胱氨酸的构建体始终缺少Cys28残基，正确的S-S桥与具有5个半胱氨酸的构建体相似。在AL1实验室中分析突变体118、119、130、135、133、134、137和C28Y+HIS(106)以及C28Y-HIS(108)。在分析实验室AL2中用不同的仪器分析突变体106origami、136、138、139、140和野生型123。AL1中的质i普仪灵敏度高于AL2中的，因此，无法获得在AL2中分析的突变体的半定量分析。然而，可以确定是否存在正确形成的SS桥。表12中给出了所获得的数据的概况。结果编制为3个类别游离巯基、桥连半胱氨酸和二聚体半胱氨酸。游离半胱氨酸表示没有形成二硫键的巯基。桥连半胱氨酸是分子内二硫键，二聚体半胱氨酸代表分子间的二硫键。W表示各肽检测到弱信号，X代表给出强信号的肽。在AL2中分析的突变体用*标记。表12:所有测试的突变体的肽图分析<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>具有5个半胱氨酸的Mycograb的"正确地"重折叠应为T4肽的游离巯基给出显著的信号，并且相应的其他游离巯基没有信号。此外，预期正确的二硫键T3-T9和T12-T17有强信号，且不正确的二硫键不应存在。最后，不应该存在分子间二碌u键。具有4个半胱氨酸的Mycograb的"正确地"重折叠不应该有任何游离巯基。只应检测到正确的S-S键T3-T9和T12-T17。此外，不应该存在分子间二》克键。表12显示，无论是野生型还是突变体中的任何一个，都不是仅为正确的S-S键提供强信号。必须考虑到REF.End样品由很多折叠不同和共价聚集的种群组成，这样就存在所有可能的二硫键和游离巯基的组合的混合物。然而，有前途的突变体应至少对两种正确的S-S桥连均显示出显著的信号，这就是MYC137和突变体C28Y+HIS和C28Y-HIS的情况。在5种情况中，只发现不正确的S-S键，而对于正确的二硫键则没有获得信号，或只有微弱的信号。MYC123、MYC138、MYC139和MYC140的信号极为微弱，且样品的再分析没有产生更高的信号。虽然发现了Mycograb特异性的肽，含有半胱氨酸的肽却没有给出信号或仅有微弱信号。这可能是由于，因为在结构上封闭的切割位点，所以胰蛋白酶不能有效消化蛋白质的各自部分。还要指出，具有增加的接头长度(5和6倍，而不是3倍)的突变体更难以消化，因此不能或仅能勉强检测后洗脱的肽的信号。有趣的是，除了一个例外，共价二硫键仅在两个T9肽之间形成，对应于Cys97残基。相比于野生型，突变体Myc118、119、130、133、137和突变体C28Y+HIS和C28Y-HIS对正确的S-S键给出了更强的信号。然而，必须考虑到，是用敏感度较低的不同的质语仪对Mycl23进行分析的，并因此不能比较信号强度。源自Mycl23肽的信号可以与源自突变体106origami、136、138、139和140的信号相比较。对于这些构建体，没有一个得到正确的二疏键。只发现不正确的二硫键信号。Myc137、MycC28Y+HIS和MycC28Y-HIS的肽图结果最有希望，其对两种正确的二石克键的均有显著信号。突变体Mycl18、119和Mycl33还显示出一定数量的天然样的二硫键，然而T12-T17的信号微弱。突变体Myc130显示出T12-T17二硫键的强信号，但是没有发现第二种正确的二碌u键。结论分析结果的相关性重折叠后最好的回收率获得于MYC123(野生型)和MYC134，是通过使用Poros柱(RPCl)的滴度分析而测定的。用离液剂溶解包涵体快于用NLS溶解。用尿素或NLS溶解包涵体的RPC2色镨图是可比较的。然而，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出，由于聚集体成片条带减少，NLS相比用尿素溶解的包涵体有更强的溶解力，见图14。在离液剂溶解后通过稀释和使用不同的添加剂，如半胱氨酸、L-精氨酸、1%的NLS和低浓度尿素/盐酸胍进行重折叠，并没有在RPC2中显示出单体峰，见图12和图13。通过非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了蛋白质的完全聚集，且RPC2色谱图显示了巨峰2。当排除了1个异常值时，SECHPLC0.5%NLS测定的MW与理论上计算出的MW相关，W为0.77。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨能力不足以检测MW的所有细微差别，但是，在两个突变体之间发现迁移时间差异，该两个突变体的MW差异为理论MW的0.6kDa和用SECHPLC测定的14kDa(分别是MYC134和MYC118)。RPC2色镨图可以证实，当10个疏7JCJ^酸被更亲水的M酸代替时，突变体的疏水性下降(MYC130)。接头元件不易影响固定相的结合位点，并因此对保留行为没有影响。还观察到，对比具有较短接头的构建体，具有增加的接头长度的构建体的肽图分析对目的肽给出的信号更弱。似乎接头元件不容易受消化酶影响。相对于其它试验的样品，MYC137、138和139的RPC2色谱图显示最尖锐的峰，其为Mycograb单体，表明样品增强的均匀性。肽图分析表明，对于有4个半胱氨酸的突变体，REF.End样品中几乎不存在游离巯基。这表明几乎完全形成二硫键(不正确的和正确的)，并形成共价聚集体。对于有5个半胱氨酸的突变体，对于各种游离巯基获得弱信号，但只有突变体MYC118、Mycll9和Mycl33在T4第五个半胱氨酸的位置有游离巯基，其在"天然"单体中应保持为还原的。这表明，在T4肽上的巯基优选形成二石克键，因为所有具5个半胱氨酸的突变体均给出了游离巯基的信号，但只在其中的3个中检测到位于T4的游离巯基。用SECHPLC测定的MW非常依赖于样品中的緩冲液基质。必须建立几个SECHPLC方法，其运转緩沖液与样品緩冲液相似。测定MW的基质依赖性使得难以对比处理步骤之间的MW(表IO)。UFDF试验表明，NLS在一定程度上保留在样品溶液中，并且不能被有效地移除。突变体MYCC28Y+HIS、C28Y-HIS和MYC137的肽图获得的结果特别乐观。结果表明，带有HIS标记和只有4个半胱氨酸的突变体是尤其优选的。HIS标记对于用高效纯化步骤IMAC纯化是必须的。只有4个半胱氨酸的构建体更可能形成正确二硫键和更少的共价聚集体。突变体的作用突变的最有利的影响可以归功于第5个半胱氨酸的移除。与具有5个半胱氨酸的构建体相比，正确的二硫键数目增加。此外，包涵体的溶解性比具5个半胱氨酸的构建体提高。交换重链和轻链片段的定位对RPC2中保留时间影响很小，其中相对于N-末端定位，当Vt元件在C末端时，保留时间减少。移除NLS后肽的聚集趋势可能随接头元件数增加。权利要求1.包含由氨基酸间隔物连接的VH结构域和VL结构域的scFv肽，其中该VH结构域包含与SEQIDNO.64的序列具有至少80％序列同一性的序列，该VL结构域包含与SEQIDNO.66的序列具有至少80％序列同一性的序列，其中scFv肽在VH结构域中对应于C28的位置上包含氨基酸取代或者缺失。2.根据权利要求1所述的scFv肽，其中在VH结构域中氨基酸的取代是C28Y。3.根据权利要求1或2所述的scFv肽，其中该氨基酸间隔物包含(GGGGS、序列。4.根据前述权利要求任一项所述的scFv肽，其还包含纯化标记，优选为在C末端的6组氨酸残基序列。5.根据前述权利要求任一项所述的scFv肽，其包含选自SEQIDNO.8、10、14、18和22的氨基酸序列，其中Xaa表示除半胱氨酸以外的氨基酸残基，其中N-末端蛋氨酸残基可被任选地切除，优选其中Xaa表示酪氨酸残基。6.核酸分子，其包含编码根据前述权利要求任一项所述的scFv肽的序列。7.根据权利要求6所述的核酸分子，还包含位于编码scFv肽的序列的3，端的(taa)n序列，其中n为l或2。8.根据权利要求6或7所述的核酸分子，其中该分子包含选自SEQIDNO.7、9、13、17和21的序列，其中nnn表示编码除半胱氨酸残基以外的氨基酸的密码子。9.根据权利要求6至8任一项所述的核酸分子，其中该分子是DNA或RNA分子。10.药物組合物，其包含根据权利要求1至5任一项所述的scFv肽，并组合可药用的赋形剂、稀释剂或载体。11.组合制剂，其包含根据权利要求1至5任一项所述的scFv肽，和抗真菌剂或抗癌剂。12.组合物，其包含根据权利要求1至5任一项所述的scFv肽，和抗真菌剂或抗癌剂。。13.治疗真菌感染的患者的方法，方法包含对患者施用有效量的根据权利要求1至5任一项所述的scFv肽。14.根据权利要求13所述的方法，还包含对患者施用有效量的抗真菌剂的步骤。15.根据权利要求1至5任一项所述的scFv肽在治疗真菌感染中的用途。16.根据权利要求14或15中所述的方法或者根据权利要求15中所述的scFv肽，其中该真菌感染是由念珠菌、隐球菌、组织胞浆菌、曲霉菌、球拟酵母病、毛霉菌病、芽生菌病、球孢子菌病或副球孢子菌病生物引起。17.根据权利要求11所述的组合制剂、根据权利要求12所述的组合物、根据权利要求13、14或16所述的方法或者根据权利要求15或16所述的scFv肽，其中该抗真菌剂是唑类抗真菌药剂，优选地选自〗尹曲康唑、伏立康唑、艾沙康唑、氟康唑、咪康唑、酮康唑和泊沙康唑。18.根据权利要求11所述的組合制剂、根据权利要求12所述的组合物、根据权利要求13、14或16所述的方法或者根据权利要求14或16所述的scFv肽，其中该抗真菌剂选自多烯抗真菌剂和棘^l白素抗真菌剂。19.根据权利要求18所述的组合制剂、组合物、方法或scFv肽，其中该多烯抗真菌剂包含两性霉素B或其衍生物。20.治疗癌症患者的方法，包含对有需要的患者施用有效量的才艮据权利要求1至54壬一项所述的scFv肽。21.根据权利要求20所述的方法，还包含对患者施用有效量的至少一种另外的抗癌剂的步骤。22.根据权利要求1至5任一项所述的scFv肽在癌症治疗中的用途。23.根据权利要求11所述的组合制剂、根据权利要求12所述的组合物、根据权利要求20或21所述的方法或者根据权利要求22所述的scFv肽，其中该抗癌剂选自阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、赫赛汀、多西紫杉醇、顺铂、伊马替尼、紫杉醇、多西紫杉醇、羟基脲、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康、阿糖胞苷和雷替曲塞。24.治疗患有涉及TNFa和/或IL-6水平升高的疾病的患者的方法，包含对患者施用有效量的根据权利要求1至5任一项所述的scFv肽。25.根据权利要求1至5任一项所述的scFv肽在涉及TNFa和/或IL-6水平升高的疾病的治疗中的用途。26.根据权利要求24所述的方法或根据权利要求25所述的scFv肽，其中该涉及TNFa和/或IL-6水平升高的疾病选自败血症、全身炎症反应综合症(SIRS)和自身免疫性疾病。27.根据权利要求26所述的方法或scFv肽，其中该自身免疫性疾病选自克罗恩氏病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎和系统性红斑狼疮。28，栽体分子，其包含根据权利要求6至9任一项所述的核苷酸序列。29,宿主细胞，其包含根据权利要求28所述的载体分子。30.生产根据权利要求1至5任一项所述的scFv肽的方法，其包含培养已在其中并入表达载体的宿主细胞，所述表达栽体包含受适当的转录调控元件的控制的、根据权利要求6至9任一项所述的核酸分子，在足以表达宿主细胞中所述肽的条件下进行培养，从而引起所述肽的生产，并回收由所述细胞生产的肽。全文摘要本发明公开了包含由氨基酸间隔物连接的V<sub>H</sub>结构域和V<sub>L</sub>结构域的scFv肽。该V<sub>H</sub>结构域包含与SEQIDNO.64的序列具有至少80％序列同一性的序列。该V<sub>L</sub>结构域包含与SEQIDNO.66的序列具有至少80％序列同一性的序列。该scFv肽还在V<sub>H</sub>结构域中对应于C<sub>28</sub>的位置上包含氨基酸取代或者缺失。文档编号C12N15/10GK101679517SQ200880013913公开日2010年3月24日申请日期2008年4月24日优先权日2007年4月27日发明者J·伯尼,P·韦克纳申请人:诺瓦提斯公司

文档序号 : 【 570258 】

技术研发人员：Ｊ.伯尼,Ｐ.韦克纳
技术所有人：诺瓦提斯公司

备注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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Ｊ.伯尼丨Ｐ.韦克纳丨诺瓦提斯公司

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