中药黄连与吴茱萸的提取物联合5-氟尿嘧啶在制备治疗肠癌药物中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及中药复方左金方与化疗药物联合治疗的新用途。
【背景技术】
[0002] 大肠癌是消化系统中常见的恶性肿瘤之一，包括结肠癌和直肠癌，每年全球有约 120万名患者被确诊为结直肠癌，而有超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌，其发病率 和死亡率分别位于第三位和第四位。男性结直肠癌的发病率高于女性，结直肠癌发病率在 40岁以下年龄段较低，但会随着年龄的增大而增加。大肠癌是中国最常见也是目前最受关 注的恶性肿瘤之一。从90年代开始，发达国家的结直肠癌发病率开始逐年下降，但是中国等 亚洲发展中国家仍逐年上升，在男性患者中这一流行病学特征更加明显，严重威胁着人类 的身体健康。
[0003] 手术被认为是目前治疗结肠癌的主要手段，但由于结肠癌发病的隐蔽性和诊疗手 段的局限性，多数结肠癌发现时已进入结肠癌发病中晚期，不适于手术治疗。目前临床上对 肠癌一般采取以化疗为主、放疗、生物免疫治疗等为辅的治疗手段。但化疗有巨大的不良反 应，导致急性肝损伤和肾脏损伤等，大大限制了化疗药物用量，阻碍了药物功效的发挥，此 外放疗治疗容易导致放射性脑、脊髓损伤、放射性脑神经损伤、放射性唾液腺损伤以及放射 性的后诱发癌等并发症。
[0004] 因此，中医药结合化疗治疗中晚期肠癌越来越显出优势。中医药对大肠癌的治疗 研究已经涉及肿瘤发生、发展、死亡、衰老等领域，在大肠癌治疗中发挥了积极的作用。大量 医疗实践证明：中医药配合大肠癌手术切除后的辅助治疗(化学、靶向、基因、放射、内分泌、 生物疗法等），对降低复发、减轻毒副反应、延长病人生存期、提高患者生活质量都有明显的 优势.此外，中医药的成本相对较低，实用性广。但是中药抗肠癌制剂单调，疗效不确切，目 前尚无具有广泛治疗作用的临床制剂问世，大多数中药制剂为辅助治疗用药，其临床应用 缺乏规范，且应用效果不理想，严重制约了抗肠癌中药及其复方的广泛应用和得到国际社 会的认可。
[0005] 左金方（Zou jinPerscription)出自《丹溪心法》，由君药黄连（Coptischinensis ?1')和佐使药吴茱萸化￥0(1丨31'11丨36〇3印(]188.外6111：11.)按6:1重量比例组成，被各药典收 载，其药性偏寒，主治肝郁化火，胃失和降，胁痛脘痞、呕吐吞酸、嘈杂似饥、脉弦数而口苦舌 赤等偏于胃火较甚者。现代医理研究表明左金方有保护胃粘膜、抑制胃酸分泌、抗溃疡、影 响胃肠运动的作用。目前临床常用于急慢性胃炎和消化性溃疡。近来，研究证明左金方能诱 导体外培养肠癌细胞HT-29的凋亡，它通过上调肿瘤组织中的Bax蛋白的表达，降低Bcl-2和 Survivin蛋白的表达，显著抑制了人肠癌裸小鼠移植瘤的生长。
[0006] 目前以术前氟尿嘧啶(5-FU)为基础的放化疗是局部晚期直肠癌的标准治疗。5-FU 是放疗增敏剂，但对有远处转移患者的治疗效果不佳，会带来一些如肛门和性功能损伤的 问题，且不能使生存期进一步延长。所以，由于5-FU具有生物利用度低，对肿瘤细胞选择性 小，毒副作用大，治疗剂量与中毒剂量接近等缺点，大大限制了其临床应用。
[0007] 中国专利申请101785807A公开了质量比为6:1的中药黄连与吴茱萸的提取物在制 备治疗胃癌药物中的应用，以及中药复方左金方在制备治疗胃癌药物中的应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供中药黄连与吴茱萸的提取物与5-FU(5-氟脲嘧啶)联合在制 备治疗肠癌药物中的用途。
[0009] 根据本发明的一方面，中药黄连与吴茱萸的提取物与5-FU(5-氟脲嘧啶)联合用于 治疗肠癌，优选的是将质量比为6:1的中药黄连与吴茱萸的提取物与化学治疗剂5-氟脲嘧 啶联合应用，更优选的是以中药复方左金方的制备方式制备所述提取物，因此复方左金方 以及依据该复方制备的左金丸均包含在本发明范围内，此外，本领域技术人员可以理解的 是，以左金方为基础药方，添加其他辅助药材制备的复方药物也包含在本发明中。在肠癌的 治疗中，所述联合是指同时给药或者序惯给药，即在给予患者提取物之前或者同时或者之 后给予5-FU。
[0010]本发明通过细胞体外试验证明，中药黄连与吴茱萸的提取物与5-FU联合用药比提 取物单独，或者5-FU单独用药对肠癌的治疗效果更好。中药黄连与吴茱萸的提取物与5-FU 联合用药，显著提高了 FHC人正常结肠直肠粘膜上皮细胞的存活率，大幅降低了 5-FU的细胞 毒性作用，通过促进HT-29细胞中Bax蛋白的高表达和Bcl-2、Survivin蛋白的低表达，促进 人肠癌细胞的凋亡。本发明的研究成果对降低临床抗肠癌化疗药物的毒副作用，提高治疗 效果，具有重大的意义。
【附图说明】
[0011]图1是本发明左金方作用于FHC人结肠直肠粘膜上皮细胞的CCK-8试验结果，显示 提取物浓度、作用时间与FHC存活率的关系；
[0012]图2是本发明5-FU作用于FHC人结肠直肠粘膜上皮细胞的CCK-8试验结果，显示5-FU浓度、作用时间与FHC存活率的关系；
[0013]图3是本发明左金方作用于结肠癌细胞HT-29的流式细胞仪检测结果，显示提取物 浓度、作用时间与HT-29凋亡率的关系；
[0014]图4是本发明5-FU作用于结肠癌细胞HT-29的流式细胞仪检测结果，显示5-FU浓 度、作用时间与HT-29凋亡率的关系；
[0015] 图5是空白对照，1.00yg/mL左金方，50.0yg/mL 5-FU以及1.00yg/mL左金方联合 50 . Oyg/mL 5-FU分别作用FHC细胞24h的CCK-8试验结果，显示特定浓度的提取物、5-FU、提 取物联合5-FU与FHC存活率的关系；
[0016] 图6是空白对照，1 ·00yg/mL左金方，100·Oyg/mL 5-FU以及1 ·00yg/mL左金方联合 100.Oyg/mL 5-FU分别作用FHC细胞24h的CCK-8试验结果，显示特定浓度的提取物、5-FU、提 取物联合5-FU与FHC存活率的关系；
[0017] 图7是空白对照，1 · 00yg/mL提取物，50 · Oyg/mL 5-FU，1 · 00yg/mL提取物联合50 · ομ g/mL 5-FU分别作用HT-29细胞的流式细胞仪检测结果，显示特定浓度的提取物、5-FU、提取 物联合5-FU与HT-29凋亡率的关系；
[0018] 图8是空白对照，1.00yg/mL提取物，100.0 yg/mL 5-FU，1.00yg/mL提取物联合 100.Oyg/mL 5-FU分别作用HT-29细胞的流式细胞仪检测结果，显示特定浓度的提取物、5-FU、提取物联合5-FU与HT-29凋亡率的关系；
[0019] 图9是空白对照，1.00yg/mL左金方，100.0yg/mL 5-FU，1.00yg/mL左金方联合 100.0yg/mL 5-FU分别作用HT-29细胞24h，调节细胞中BAX、Bcl-2和Survivin蛋白表达的 Western Blotting凝胶电泳图（n = 6);
[0020] 图 10是空白对照，1.00yg/mL提取物，50.0yg/mL 5-FU，100.00yg/mL 5-FU，1.00y g/mL提取物联合50·Oyg/mL 5-FU以及1 ·00yg/mL提取物联合100·0yg/mL5-FU分别作用HT-29细胞的细胞形态学显微镜观察图（X 200)。
【具体实施方式】 [0021] -、试验材料
[0022]细胞株:FHC细胞(人正常结肠直肠粘膜上皮细胞）、HT-29细胞(人结肠癌细胞)购 自中山大学动物实验部细胞中心。用含有体积分数为10 %的FBS的DMEM完全培养基，于37 °C，5%的C02孵箱中培养3天进行一次传代，传代按1:3进行。取生长期细胞进行实验。
[0023]中药黄连与吴茱萸的提取物（下称提取物或左金方）：中药黄连（Coptis chinensis Fr)与吴茱萸(Evodiarutaecarp(Juss. )benth.)为市售购买，按6:1 质量混合， 经水煎、浓缩和冷冻干燥制成水提物。原药材经水提后，得到水提物260(mg)/生药(g)。
[0024] 左金方传统汤剂冻干粉：由本实验室提供，取30g黄连与5g吴茱萸，加8倍蒸馏水浸 泡30min，加水煎煮3次，每次30min，过滤，合并3次滤液，冷冻干燥，每克干粉含生药3.98g; 经HPLC法测定，左金方冻干粉中含小檗碱39.85%，巴马汀9.19%，药根碱4.86%，吴茱萸碱 0.17%，吴茱萸次碱0.19%。
[0025] 制备成试验中给药浓度的左金方的方法:将左金方冻干粉溶于去离子水中，配置 成lmg/mL的母液，实验时用细胞培养液稀释成所需浓度。
[0026] 5-FU:购自天津金耀氨基酸有限公司，规格：10ml: 0.25g，批号：1412011。
[0027]制备成试验中给药浓度的5-FU的方法:取适量5-氟尿嘧啶注射液原液加细胞培养 液配制成lmg/m 1母液，实验时用细胞培养液稀释成所需浓度。
[0028]二、检测方法及数据统计方法 [0029] l、CCK-8检测细胞活性
[0030] 采用CCK-8检测试剂盒在规定时间内观察左金方或者5-FU或者左金方联合5-FU对 培养FHC细胞的存活率的影响，其中将未经处理的对照组细胞的存活率设定为100%。
[0031] 2、流式细胞仪检测细胞凋亡率
[0032] 调整HT-29细胞密度为2X105/mL，以1.5mL/well种入6孔板。每组6个复孔。药物作 用24h后，细胞刷刮取细胞，800r · m
文档序号 :
【 9933695 】
技术研发人员：余惠旻,周红祖,周禹练
技术所有人：深圳大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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