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内包核酸的高分子微囊复合体及其制造方法

2025-01-18 17:00:02 568次浏览
[0218] 接着,与实施例3的(3)同样地,将包含所形成的高分子微囊复合体的反应溶液透 析3天,将该高分子微囊复合体中的硫醇氧化为SS键,使其交联。将交联化所得的物质设为 MGPM-4-Venus- (X。
[0219] (5)使pVenus变性而内包的导入cRGD的内包核酸的高分子微囊复合体的形成 [0220]除了代替上述(1)中制备的还原处理后的PEG -PLys - PDP溶液而使用上述⑵中 制备的还原处理后的cRGD - PEG-PLy s - PDP溶液以外,与上述⑷同样地得到内包来自1分 子的pVenus的2条线状单链DNA、且被交联化的MCPM-4 一 Venus - CL 一 cRGD。
[0221] (6)对胰脏癌模型小鼠的全身施予
[0222] 对与实施例2的(3)同种的胰脏癌模型小鼠,分别自尾静脉注入上述(3)、(4)及(5) 中制造的高分子微囊复合体(注入量:200yL、DNA浓度:100ngAiL)。与实施例2的(4)同样地, 从自注入起经过72小时后的小鼠外科切除移植了 BxPC3的胰脏癌组织,制作显微镜观察用 的切片,对于所得的切片,将细胞核和血管进行荧光染色。
[0223] 染色后,利用共聚焦荧光显微镜进行了观察,结果:在全身施予了直接收容pVenus 的PM-4 一 Venus - CL的小鼠的胰脏癌组织中,观察到Venus表达的细胞是组织全体的极少 部分。与此相对,在全身施予了将pVenus变性而收容的MCPM-4 -Venus -CL的小鼠的胰脏 癌组织中,在肿瘤组织深部也在非常多的细胞中观察到Venus表达。另外,在全身施予了附 加有cRGB配体的MCPM - 4 - Venu s - CL - cRGD的小鼠的胰脏癌组织中,也与MCPM - 4 - Venus - CL同样地在大量的细胞中观察到Venus表达。将全身施予了MCPM-4 一 Venus - CL的 小鼠的胰脏癌组织的荧光图像示于图10中。
[0224] [实施例5]
[0225] 与实施例3的(1)同样地,制造聚合度为20且TOP基的置换度为10 %的PEG - PLys - PDP(PEG - PLys20 - SH10%)和聚合度为69且PDP基的置换度为12%的PEG - PLys - PDP (PEG - PLys69 - SH12%)。在这些嵌段共聚物与DNA结合而形成高分子微囊复合体之前,预 先以相对于rop基成为3倍浓度的方式添加 dtt,并搅拌15分钟,将rop基还原为硫醇残基。
[0226] 接着,与实施例1的(3)同样地,在这些嵌段共聚物溶液中混合质粒pCAG - Luc溶 液,形成内包PCAG - Luc的PEG-PLy s-PDP的高分子微囊复合体。
[0227] 对所得的高分子微囊复合体,与参考例1的(6)同样地拍摄TEM图像。图11中分别示 出使用了PEG-PLys20 - SH10%的高分子微囊复合体的TEM图像(左、"20 - SH10%")和使用 了PEG - PLys69 - SH12%的高分子微囊复合体的TEM图像(右、"69 - SH12%")。在使用了 PEG - PLys20 - SH10%的高分子微囊复合体中,呈现2对比使用了PEG - PLys69 - SH12%的 高分子微囊复合体的芯明显更小的芯。与使用了PEG-PLys69 - SH12 %的情况相比,使用了 PEG-PLys20 - SHlO %时壳的PEG密度明显更高。由这些结果推测:在使用了PEG-PLys20 - SHl0 %的高分子微囊复合体中,来自pCAG-Luc的2条单链DNA各自分别凝缩成对。成对的原 因可能在于:即使在热处理后,DNA链彼此缠绕,因此凝缩后也不会完全分离。即认为:在使 用了PEG - PLys69 - SH12%的高分子微囊复合体中,来自pCAG - Luc的2条单链DNA包含在1 个芯中。
[0228] [实施例6]
[0229] 调查阳离子性高分子链嵌段彼此有无交联对内包核酸的高分子微囊复合体的形 态的影响。
[0230]与实施例3的(1)同样地,制造聚合度为21的PEG-PLys和聚合度为21且TOP基的置 换度为12%的PEG - PLys - TOP。在PEG - PLys - PDP的嵌段共聚物与DNA结合而形成高分子 微囊复合体之前,预先以相对于rop基成为3倍浓度的方式添加 dtt,并搅拌15分钟,将rop基 还原为硫醇残基。
[0231]接着,与实施例3的(2)、(3)同样地,在这些嵌段共聚物溶液中混合质粒pCAG - Luc2溶液,形成内包pCAG - Luc2的PEG - PLys的高分子微囊复合体(以下,为"MCPM-6")和 内包pCAG - Luc2并进行交联后的PEG - PLys - PDP的高分子微囊复合体(以下,为"MCPM - 6 - CL")。
[0232]对所得的高分子微囊复合体,与参考例1的(6)同样地拍摄TEM图像。图12中分别示 出使用了PEG - PLys的高分子微囊复合体(MCPM-6)的TEM图像(左)和使用了PEG - PLys - PDP的高分子微囊复合体(MCPM-6 - CL)的TEM图像(右)。另外,将由该图像算出的高分子微 囊复合体的长轴长的分布分别示于图13中。该结果可知:不认为因有无交联而使高分子微 囊复合体的芯部分的形态不同,交联对高分子微囊复合体的芯部分的形态不造成影响。
[0233] [实施例7]
[0234] 调查核酸变性温度对内包核酸的高分子微囊复合体的大小及形态的影响。
[0235] 与实施例6同样地制造聚合度为21的PEG-PLys。
[0236] 接着,除了以25°C、70°C、80°C或95°C进行10分钟的线状DNA溶液的加热处理以外, 与实施例6同样地形成内包pCAG - Luc2的PEG-PLys的高分子微囊复合体。
[0237] 对所得的高分子微囊复合体,与参考例1的(6)同样地拍摄TEM图像,调查基于由所 得图像算出的高分子微囊复合体的长轴长及纵横比的分布。将结果示于图14中。由该结果 可知:通过以室温以上的温度(70°C以上)进行加热处理,从而使长轴长、纵横比均变小,且 高分子微囊复合体间的分散也变小。尤其可知:通过以95°C进行加热处理,从而得到小粒径 且小分散的高分子微囊复合体集团。
[0238] [实施例8]
[0239] 对使用了内包核酸的高分子微囊复合体向培养细胞株导入基因进行了调查。
[0240] 首先,使用24孔板,将来自人胰脏癌腺癌的细胞株BxPC-3以12000ce 11 s/孔(400μ L/孔的培养液中、3 X 104cells/mL)进行液体培养。培养基使用包含10%胎牛血清(FBS)及 5%青霉素/链霉素的RPMI -1640。以37°C培养24小时后,使用与实施例3(1)同样地得到的 PEG - PLys72(PLys嵌段的聚合度:72)的高分子微囊复合体(以下,为"MCPM-8")溶液、或 PEG-PLys69 - SHl2 %的经交联化的高分子微囊复合体(以下,为"MCPM-8 - CL")溶液30yL (33ng/yL),各样品各转染6例。对照使用HEPES。
[0241] 在24小时后进行培养基交换,之后培养3天。其后,用I3BS溶液洗涤3次,使用150yL 的被动裂解缓冲液(passive lysis buffer)进行回收。使用溶解物40yL,利用GloMax? 96 Microplate Luminomater,以减去背景后的焚光强度对焚光素酶基因的表达进行定量。将 结果不于图15中。
[0242] 由该结果可知:本发明的高分子微囊复合体无论有无交联均被导入至人培养细胞 株中,并且该高分子微囊复合体所含有的基因在人培养细胞株中得以表达。
[0243] [实施例9]
[0244] (I)PEG-PLys-PDP
[0245] 与实施例4的(1)同样地制造聚合度为21且PDP基的置换度为12 %的PEG - PLys - PDP。在PEG - PLys - PDP的嵌段共聚物与DNA结合而形成高分子微囊复合体之前,预先以相 对于rop基成为3倍浓度的方式添加 Dir,并搅拌15分钟,将rop基还原为硫醇残基。
[0246] (2)使pCAG - sFlt - 1变性而内包的内包核酸的高分子微囊复合体的形成
[0247] 在质粒pCAGGS(由理研基因库提供)中重组sFlt - 1基因,制作质粒pCAG - sFlt - UsFlt - 1基因是被认为通过与血管新生有关的血管内皮细胞增殖因子受体(VEGFR)拮抗 而阻碍血管新生、具有抗肿瘤效果的基因。对所得的pCAG-sFlt - 1进行限制酶处理,将1个 部位消化为线状。将包含该线状DNA的DNA溶液在95°C加热处理10分钟,使线状化的pCAG - sFlt - 1变性为单链。
[0248] 在上述(1)中制造的PEG-PLys - TOP溶液中以使N/P比成为2的方式快速混合变性 成单链的线状PCAG-sFlt - 1溶液,由此形成内包来自1分子的质粒pCAG-sFlt - 1的2条线 状单链DNA的PEG - PLys - PDP的高分子微囊复合体(以下,为"MCPM-9 一 sFltl - TOP")。反 应溶剂为IOmM HEPES缓冲液(pH7.3),反应溶液中的pDNA浓度为lOOng/yL。
[0249] 接着,与实施例3的(3)同样地,将包含所形成的MCPM-9 -sFltl -PDP的反应溶液 透析3天,将该高分子微囊复合体中的硫醇氧化为SS键,使其交联。将交联化所得的物质设 为 MCPM-9 -sFltl-CL。
[0250] 作为对照,除了利用加热处理使pCAG - sFlt - 1变性以外与上述(2)同样地形成所 得到的高分子微囊复合体(以下,为"PM-9-sFltl-CL"),并且除了利用与参考例垌样的 方法代替sFlt - 1基因而重组Luc2基因以外与上述(2)同样地形成所得的高分子微囊复合 体(以下,为 "MCPM- 9 - Luc2 - CL")。
[0251] (3)对胰脏癌模型小鼠的全身施予
[0252] 对与实施例3的(6)同种的胰脏癌模型小鼠,间隔2天共计3次(第0天、第3天、第6 天)每次200yL(质粒或pDNA浓度:100ngAiL)各自从尾静脉注入上述(2)中制造的3种高分子 微囊复合体的任一种或HEPES。
[0253] 将22天间测定小鼠的胰脏癌的体积的结果示于图16中。由该结果可知:通过施予 "MCPM-9一Fl11 - CL",从而有效地抑制小鼠的肿瘤增殖。
[0254] 产业上的可利用性
[0255] 本发明的内包核酸的高分子微囊复合体因粒径小、且构成该内包核酸的高分子微 囊复合体的壳的非电荷性亲水性高分子链嵌段的密度也高,因此血中滞留性、肿瘤血管透 过性及肿瘤组织渗透性优异。因此,本发明的内包核酸的高分子微囊复合体可以通过经静 脉施予等全身施予而将内包的DNA有效地导入至癌组织深部。因此,本发明的内包核酸的高 分子微囊复合体并不受限定,但是作为用于将治疗用基因送达到靶标细胞的基因载体是非 常有用的。可以利用在制药或医疗产业中。例如,期待通过本发明还能通过对血管透过性低 的难治性癌的全身施予来实现基因治疗。
【主权项】
1. 一种内包核酸的高分子微囊复合体,其特征在于,其由含有非电荷性亲水性高分子 链嵌段及阳离子性高分子链嵌段的嵌段共聚物、与包含1000个碱基长度以上的彼此互补的 碱基序列的2条单链DNA、至少双螺旋结构的一部分解离为单链结构的1000个碱基对长度以 上的双链DNA、或1000个碱基长度以上的1条单链DNA形成。2. 根据权利要求1所述的内包核酸的高分子微囊复合体,其由含有非电荷性亲水性高 分子链嵌段及阳离子性高分子链嵌段的嵌段共聚物、与包含1000个碱基长度以上的彼此互 补的碱基序列的2条单链DNA、或至少双螺旋结构的一部分解离为单链结构的1000个碱基对 长度以上的双链DNA形成。3. 根据权利要求1或2所述的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,所述单链DNA为2000 个碱基长度以上,所述双链DNA为2000个碱基对长度以上。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的内包核酸的高分子微囊复合体,其在水性介质中 的采用动态光散射法得到的平均粒径为l〇〇nm以下。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,DNA和利用 静电相互作用与DNA结合的阳离子性高分子链嵌段形成芯部分,非电荷性亲水性高分子链 嵌段形成壳部分。6. 根据权利要求5所述的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,所述芯部分的平均粒径 为50nm以下。7. 根据权利要求1~6中任一项所述的内包核酸的高分子微囊复合体,其为球体状。8. 根据权利要求1~7中任一项所述的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,所述单链 DNA或所述双链DNA为线状。9. 根据权利要求1~8中任一项所述的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,所述嵌段 共聚物的至少一部分彼此交联。10. 根据权利要求1~9中任一项所述的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,在所述阳 离子性高分子链嵌段的主链或侧链以共价键结合有疏水性基。11. 根据权利要求1~1 〇中任一项所述的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,在所述 阳离子性高分子链嵌段的侧链具有乙胺结构或丙胺结构。12. -种内包核酸的高分子微囊复合体的制造方法,其特征在于,其是制造收容有DNA 的内包核酸的高分子微囊复合体的方法, 该方法具有如下工序:将含有非电荷性亲水性高分子链嵌段及阳离子性高分子链嵌段 的嵌段共聚物、与使双螺旋结构的至少一部分解离的状态的1000个碱基对以上的双链DNA 在水性介质中混合。13. 根据权利要求12所述的内包核酸的高分子微囊复合体的制造方法,其中,所述双链 DNA为2000个碱基对长度以上。14. 根据权利要求12或13所述的内包核酸的高分子微囊复合体的制造方法,其中,所述 双链DNA为线状。15. 根据权利要求12~14中任一项所述的内包核酸的高分子微囊复合体的制造方法, 其中,所述双链DNA为在60°C以上变性后的双链DNA。
【专利摘要】本发明的内包核酸的高分子微囊复合体,其特征在于,其由含有非电荷性亲水性高分子链嵌段及阳离子性高分子链嵌段的嵌段共聚物、与包含1000个碱基长度以上的彼此互补的碱基序列的2条单链DNA、至少双螺旋结构的一部分解离为单链结构的1000个碱基对长度以上的双链DNA、或1000个碱基长度以上的1条单链DNA形成。
【IPC分类】C12N15/115, A61K31/711, A61K9/107, A61K47/34, A61K48/00, A61K31/713
【公开号】CN105451719
【申请号】CN201480043775
【发明人】片冈一则, 长田健介, 赛奥弗里斯·阿格里斯·由佳利
【申请人】国立研究开发法人科学技术振兴机构
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年8月5日
【公告号】CA2920328A1, EP3031447A1, EP3031447A4, US20160184457, WO2015020026A1
文档序号 : 【 9692029 】

技术研发人员:片冈一则,长田健介,赛奥弗里斯·阿格里斯·由佳利
技术所有人:国立研究开发法人科学技术振兴机构

备 注:该技术已申请专利,仅供学习研究,如用于商业用途,请联系技术所有人。
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片冈一则长田健介赛奥弗里斯·阿格里斯·由佳利国立研究开发法人科学技术振兴机构
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