内包核酸的高分子微囊复合体及其制造方法
[0170] [实施例2]
[0171] 使用在CAG启动子的下游包含编码荧光绿色蛋白GFP的基因的质粒pCAG-AcGFP (6.5kbp、由理研基因库提供），通过直接内包pDNA的以往方法和以使pDNA的双螺旋结构解 离的状态与嵌段共聚物结合的方法，分别制造内包GFP基因的高分子微囊复合体，全身施予 至使胰脏癌发病的模型小鼠中，调查胰脏癌组织中的GFP表达。予以说明，pCAG-AcGFP是在 质粒pCAGGS (由理研基因库提供）中重组编码GFP的基因的质粒。
[0172] (1)直接内包pGFP的内包核酸的高分子微囊复合体的形成
[0173] 在实施例1中制造的PEG - PAsp (DET) - Cho I e溶液中以使N/P比为4的方式快速混 合质粒pGFP溶液，由此形成内包pDNA的PEG - PAsp(DET) - Chole的高分子微囊复合体（以 下，为"PM-2 - GFP"）。反应溶剂为IOmM HEPES缓冲液(pH7.3)，反应溶液中的质粒浓度为 100ng/uL〇
[0174] (2)使pGFP变性而内包的内包核酸的高分子微囊复合体的形成
[0175] 在质粒pGFP溶液中添加限制酶进行限制酶处理，将pGFP的1个部位消化为线状。将 包含该线状DNA的DNA溶液在95°C加热处理10分钟，使线状化的pGFP变性为单链。接着，在经 变性的状态的DNA溶液中以使N/P比成为4的方式快速混合PEG-PAsp(DET) - Chole溶液，由 此形成内包来自1分子pGFP的2条线状单链DNA的PEG - PAsp(DET) - Chole的高分子微囊复 合体（以下，为"MCPM - 2 - GFP"）。反应溶剂为IOmM HETOS缓冲液（pH7.3)，反应溶液中的 pDNA 浓度为 I OOng/yL。
[0176] (3)胰脏癌模型小鼠
[0177] 作为胰脏癌模型小鼠，使用了将人胰脏腺癌细胞株BxPC3移植到胰脏的模型小鼠。
[0178] 该胰脏癌模型小鼠按照以下方式获得。首先，在BALB/c裸鼠 （Charles River Laboratories公司制）的皮下接种悬浮于IOOyL的I3BS(磷酸缓冲生理食盐水）的BxPC3(l X IO7细胞）。肿瘤在10天进展至增殖期(肿瘤的大小为75mm3程度）。
[0179] (4)对胰脏癌模型小鼠的全身施予
[0180] 对胰脏癌模型小鼠，分别从尾静脉注入上述（1)、（2)及实施例1的（4)中制造的高 分子微囊复合体(注入量:20(^1^、0嫩浓度：1001^/^〇。自从注入起经过72小时后的小鼠，外 科切除移植了BxPC3的胰脏癌组织，在干燥冷却后的丙酮中使其冷冻后，通过低温恒温器 ((^7〇8丨81:)制作厚度1(^1]1的薄层切片。对所得的切片，使用!1〇6〇8丨33342对细胞核进行染 色。另外，使用抗小鼠 PECAM - 1抗体(BD Pharmingen公司制）以及抗人及小鼠 VEGFRl抗体 (制品编号:ab32152、Abcam Japan公司制)对血管内皮细胞进行染色。
[0181] 染色后，利用共聚焦荧光显微镜（制品编号:CLSM7 80、Car I Ze i s s公司制)进行了 观察，结果:在全身施予了PM-2 - GFP的小鼠的胰脏癌组织中，观察到GFP表达的细胞是组 织全体的极少部分。与此相对，全身施予了MCPM- 2-GFP的小鼠的胰脏癌组织中，肿瘤组织 深部也在非常多的细胞中观察到GFP表达。将由荧光显微镜拍摄的荧光图像示于图5~7中。 图5表示全身施予了MCPM - 2 - GFP的小鼠的胰脏癌组织的荧光图像，图6表示全身施予了 PM- 2-GFP的小鼠的胰脏癌组织的荧光图像，图7表示全身施予了MCPM- 1的小鼠的胰脏癌 组织的荧光图像。
[0182]由该荧光图像测定移植了BxPC3的胰脏癌组织中表达的GFP的荧光强度（图像的亮 度），计算减去背景的8个影像的平均值作为荧光强度。将施予了 PM-2-GFP的小鼠和施予 了MCPM- 2 - GFP的小鼠的测定结果示于图8中。在施予了MCPM- 2-GFP的小鼠中，胰脏癌的 肿瘤组织深部的GFP表达为施予了 PM-2-GFP的小鼠的10倍以上。
[0183] [实施例3]
[0184] 调查阳离子性高分子链嵌段彼此有无交联对全身施予内包核酸的高分子微囊复 合体时的血中滞留性的影响。
[0185] (I)PEG-PLys-PDP
[0186] 与参考例1的（1)同样地，使用α-甲氧基一ω-氨基PEG(PEG、Mw=20kDa)作为引 发剂，使NCA进行开环聚合，由此制造 PEG -PLys(TFA)。此时，通过调节引发剂与单体NCA之 比，从而制造聚合度不同的3种PEG-PLys(TFA)。对如此得到的3种PEG-PLys(TFA)的TFA基 进行脱保护，得到聚合度(下述式中，为"π2"）为20、40、及70的3种PEG-PLys。
[0187] 接着，进行吡啶二硫基丙酰基(PDP基)对PEG - PLys的导入。该导入使用N-琥珀酰 亚胺基3-（2-吡啶二硫基）丙酸酯（SPDP)来进行。使TOG - PLys的溴酸盐溶解于0.1N、 pH6.5的乙酸缓冲液中，并对该缓冲液进行透析，并将抗衡离子交换为乙酸根离子来使用。 使PEG-PLys乙酸盐(200mg)和SroP(56mg、相对于赖氨酸残基为0.5摩尔当量)溶解于5mL的 N -甲基吡咯烷酮(NMP、添加5质量％的氯化锂并对其进行脱气）。为了将胺脱质子化而在该 溶液中添加〇. 5mL的N，N-二异丙基乙胺，并开始反应。反应液在室温下搅拌1小时，反应的 追踪通过反相色谱法来进行。
[0188] 反应结束后，将反应液滴加到作为PEG的不良溶剂的醚中而使其再沉淀。使粗生成 物溶解于甲醇后，在醚中使其再沉淀，重复该操作，去除水中不需要的杂质。过剩的盐通过 使生成物溶解于〇. IN的乙酸水溶液并对蒸馏水透析1小时来去除。对最终精制物进行冷冻 干燥并回收。
[0189] 所得的高分子的结构通过1H-NMR测定来确认。PDP基的置换度通过1H-NMR测定和 UV测定来确定。在1H - NMR测定中，使用D2O作为溶剂，并由PDP基的吡啶基的质子（C3H4N: 7.6ppm)和PEG的亚甲基的质子(OCH 2CH2:3.5ppm)的峰的强度比求得置换度。在UV测定中，由 将TOP基利用二硫苏糖醇(Clithiothreitol)(DTT)还原时游离的2 -硫代吡啶酮的吸光度(λ max = 343nm.e = 7.06X 103)求得置换度。利用不同的两种方法求得的置换度非常一致，显 示在来自赖氨酸的重复单元的氨基的约12 %中导入了I3DP基。
[0190]在所得的PEG - PLys - PDP与DNA结合而形成高分子微囊复合体之前，预先以相对 于I3DP基成为3倍浓度的方式添加 DTT，并搅拌15分钟，将rop基还原为硫醇残基。
[0193] (2)使经荧光标记的pDNA变性而内包的未交联的内包核酸的高分子微囊复合体的 形成
[0194] 对参考例1中使用的被荧光物质Cy (注册商标)5标识过的质粒pCAG - Luc2进行限 制酶处理，并将1个部位消化为线状。将包含该线状DNA的DNA溶液在95°C加热处理10分钟， 使线状化的荧光标记PCAG - Luc2变性为单链。接着，在经变性的状态的DNA溶液中以使N/P 比成为2的方式快速混合上述（1)中制备的还原处理后的PEG-PLys-TOP溶液，由此形成内 包来自1分子的荧光标记PCAG-Luc2的2条线状单链DNA的PEG-PLys - TOP的高分子微囊复 合体（以下，将使用来自赖氨酸的重复单元的聚合度20、40、或70的高分子的情况分别记作 "MCPM-3 -PLys20"、"MCPM-3 -PLys40"、"MCPM-3 -PLys70"）。反应溶剂为IOmM HEPES缓 冲液(pH7.3 )，反应溶液中的pDNA浓度为I OOng/yL。
[0195] (3)使经荧光标记的pDNA变性而内包、且将嵌段共聚物彼此交联化的内包核酸的 高分子微囊复合体的形成
[0196] 将包含上述（2)中所形成的高分子微囊复合体的反应溶液，使用分级分子量 6000 - 8000的透析膜，对IL的IOmM磷酸缓冲液(pH7.4)进行透析，除去DTT等。透析持续3天， 此期间，利用空气中的氧将硫醇氧化为SS键而使其交联。利用ElIman法来确认在3天的透析 后不存在未氧化的硫醇。将使MCPM-3 - PLys20交联化的物质设为MCPM-3 - PLys20 - CL， 将使 MCPM-3 - PLys40交联化后的物质设为 MCPM- 3 - PLys40 - CL，将使 MCPM- 3 - PLys70 交联化后的物质设为MCPM-3-PLys70 - CL。
[0197] (4)血中滞留性的评价
[0198] 从小鼠的侧面尾静脉注入上述(2)及(3)中所形成的高分子微囊复合体(注入量： 200yL、DNA浓度：100ngAiL)。对4只小鼠分别施予各高分子微囊复合体。从自施予起经过30 分钟后的小鼠的大静脉采取血液，通过离心分离处理制备血清。在所得的血清中加入胰蛋 白酶和硫酸葡聚糖，在3 7 °C孵育一夜。使用荧光分光光度计（制品名：N a η 〇 D r 〇 p (N D - 3300)^111^叫丨〇11公司制）对孵育后的血清的07(注册商标）5的荧光强度(67011111)进行测 定。
[0199] 全身施予后经过30分钟后的小鼠的血中滞留的高分子微囊复合体量的比例（％ ) 利用下述式子来计算。式中，[F67Q(样品）]是指:从施予了高分子微囊复合体的小鼠制备的 血清（与胰蛋白酶和硫酸葡聚糖孵育后的血清）的670nm的荧光强度的测定值。另外，[F 670 (对照）]是指:对在从未施予高分子微囊复合体的小鼠制备的血清中添加与对小鼠施予的 高分子微囊复合体等量的高分子微囊复合体后的血清(对照血清），与样品同样地添加胰蛋 白酶和硫酸葡聚糖，并在37°C下孵育一夜后的血清的670nm的荧光强度的测定值。
[0200] [在血中滞留的高分子微囊复合体量的比例（％)] = [F67Q(样品）]/[F67Q(对照）]X 100
[0201] 将测定结果示于图9。图9中、"MCPM"表示施予了 "MCPM-3 -PLys20"、"MCPM-3 - PLys40" 及 "MCPM- 3-PLys70" 的小鼠的结果，"MCPM-CL" 表示施予了 "MCPM-3 - PLys20 - CL"、"MCPM-3 - PLys40 - CL"及"MCPM-3 - PLys70 - CL"的小鼠的结果。通过使嵌段共聚物 交联化，从而显著改善血中滞留性。
[0202][实施例4]
[0203] 使用包含编码荧光绿色蛋白Venus的基因的质粒(pVenuS、5.5kbp)，利用直接内包 PDNA的以往方法和以使pDNA的双螺旋结构解离的状态与嵌段共聚物结合的方法分别制造 内包Venus基因的高分子微囊复合体，全身施予至使胰脏癌发病的模型小鼠中，调查胰脏癌 组织中的Venus表达。予以说明，pVenus是在质粒pCAGGS(由理研基因库提供）中重组编码 Venus的基因的质粒。
[0204] (I)PEG-PLys-PDP
[0205] 与参考例1的（1)同样地，使用α-甲氧基一 ω-氨基PEG(PEG、Mw=20kDa)作为引 发剂，并使NCA开环聚合，由此制造 PEG-PLys(TFA)。此时，通过调节引发剂与单体NCA之比， 从而制造聚合度不同的3种PEG - PLys(TFA)。对如此得到的3种PEG - PLys(TFA)的TFA基进 行脱保护，得到聚合度为72的PEG-PLys。
[0206]接着，与实施例3的（1)同样地，在所得的PEG -PLys中导入TOP基。所得的高分子的 结构通过1H-NMR测定来确认，结果显示在来自赖氨酸的重复单元的氨基的约12%中导入 了 TOP 基。
[0207]在所得的PEG - PLys - PDP与DNA结合而形成高分子微囊复合体之前，预先以相对 于I3DP基成为3倍浓度的方式添加 DTT，并搅拌15分钟，将rop基还原为硫醇残基。
[0208] (2) cRGD - PEG - PLy s - PDP
[0209] 环状R⑶肽(cRGD)为选择性识别在肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞过剩表达的ανβ3 及ανβ5整联蛋白的配体。合成在PEG嵌段的末端导入了cR⑶的cR⑶一 PEG-PLys-TOP。 [0210] 具体而言，除了代替α-甲氧基一ω -氨基PEG而使用α -乙酰基一ω -氨基PEG (PEG、Mw = 20kDa)作为引发剂以外，与实施例1(1)同样地得到乙酰基一 PEG-PBLA-Chole。 使所得的乙酰基一PEG-I3BLA-Chole溶解于水，用盐酸调节至pH2,将乙酰基完全变换为活 性型的醛基(酸性化的乙酰基一PEG-PBLA-Cho I e溶液）。
[0211]另外，为了切断可能在这些cycl〇{RGDfK(CX-)}肽间形成的SS键，而使其溶解于 含有为肽的10倍当量的DTT的碳酸氢钠缓冲液(0.1Ν、ρΗ7.4)中，孵育1小时(cRGD肽溶液）。
[0212] 接着，在酸性化的乙酰基一PEG - I3BLA - ChoI e溶液中，以使cR⑶肽成为乙酰基一 PEG-PBLA-Chole的10倍当量的方式，添加上述cR⑶肽溶液，调节至pH5,使其反应一夜。将 最终反应生成物cR⑶一 PEG-PAsp(DET) - Chole在IM的氯化钠水溶液中透析3次后，用去离 子水透析3次。
[0213] (3)直接内包pVenus的内包核酸的高分子微囊复合体的形成
[0214]在上述（1)中制造的PEG-PLys-TOP溶液中以使N/P比成为2的方式快速混合质粒 pVenus溶液，形成内包pVenus的PEG - PLys - PDP的高分子微囊复合体（以下，为"PM-4一 Venus"）。反应溶剂为IOmM HEPES缓冲液(pH7.3)，反应溶液中的质粒浓度为lOOng/yL。
[0215] 接着，与实施例3的（3)同样地，将包含所形成的高分子微囊复合体的反应溶液透 析3天，并将该高分子微囊复合体中的硫醇氧化为SS键，使其交联。将交联化所得的物质设 为 PM-4-Venus -CL0
[0216] (4)使pVenus变性而内包的内包核酸的高分子微囊复合体的形成
[0217] 对pVenus进行限制酶处理，并将1个部位消化为线状。将包含该线状DNA的DNA溶液 在95°C加热处理10分钟，使线状化的荧光标记pVenus变性为单链。接着，在经变性的状态的 DNA溶液中以使N/P比成为2的方式快速混合上述（1)中制备的还原处理后的PEG - PLys - PDP溶液，由此形成内包来自1分子的pVenus的2条线状单链DNA的PEG-PLys - PDP的高分子 微囊复合体（以下，为"MCPM-4 -Venus"）。反应溶剂为IOmM HEPES缓冲液(pH7.3)，反应溶 液中的pDNA浓度为lOOng/yL。
文档序号 :
【 9692029 】
技术研发人员：片冈一则,长田健介,赛奥弗里斯·阿格里斯·由佳利
技术所有人：国立研究开发法人科学技术振兴机构
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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