内包核酸的高分子微囊复合体及其制造方法
[0128] 将从最初添加于用于形成高分子微囊复合体的反应溶液中的荧光标记PEG - PLys 的量减去该上清液中的荧光标记PEG - PLys的量后所得的量，作为所形成的全部高分子微 囊复合体中所含的荧光标记PEG - PLys的总量(摩尔），将其除以最初添加于反应溶液中的 DNA量(摩尔），由此算出与1分子的pDNA结合的荧光标记PEG-PLys的平均分子数（即，每1分 子高分子微囊复合体中所含的荧光标记PEG-PLys的平均分子数、单位:链）。
[0129] 该结果为:就每1分子高分子微囊复合体中所含的荧光标记PEG - PLys的平均分子 数而言，包含PLys嵌段的聚合度为19的荧光标记PEG - PLys的高分子微囊复合体为436土 31.2链，包含PLys嵌段的聚合度为39的荧光标记PEG - PLys的高分子微囊复合体为258土 10.4链，包含PLys嵌段的聚合度为70的荧光标记PEG - PLys的高分子微囊复合体为168土 2.5链。即可知如下倾向：构成内包核酸的高分子微囊复合体的嵌段共聚物的阳离子性高分 子链嵌段的聚合度越大，每1分子高分子微囊复合体中所含的荧光标记PEG-PLys的平均分 子数越小。
[0130] (6)TEM 观察
[0131]对使用PEG - PLy s所形成的高分子微囊复合体拍摄了 TEM图像。在TEM图像中出现 构成高分子微囊复合体的DNA和PLys嵌段，无法观察到PEG。在高分子微囊复合体中，DNA形 成芯部分。即，由TEM图像可以确认高分子微囊复合体的芯部分的形状。
[0132] TEM观察及图像的取得使用电子显微镜H-7000(日立High-Technologies公司制） 在加速电压为75kV的条件下进行。测定样品通过在高分子微囊复合体溶液中添加等量的2 质量/体积％的乙酸氧铀溶液来制备。将使用离子镀膜机(ion coater)(装置名:Eiko IB - 3、Eiko Engineering公司制)预先辉光放电的400目的碳膜被覆铜网格（日新EM公司制）分 别在测定样品中浸渍30秒钟后，以TEM观察在滤纸上干燥后的碳膜被覆铜网格。TEM图像中 的高分子微囊复合体的芯部分为棒状，并将长轴的长度(L n)和短轴的长度(2rn)使用图像处 理软件ImageJ进行了测定。
[0133] 图1中示出使用PEG - PLys所形成的高分子微囊复合体的TEM图像（图中，左）和由 该图像算出的高分子微囊复合体的长轴(Ln)(棒状粒子的长度）的分布（图中，右）。图1中， "PLysl9"表示包含PLys嵌段的聚合度为19的荧光标记PEG - PLys的高分子微囊复合体的结 果，"PLys39"表示包含PLys嵌段的聚合度为39的荧光标记PEG - PLys的高分子微囊复合体 的结果，" PLys70"表示包含PLys嵌段的聚合度为70的荧光标记PEG - PLys的高分子微囊复 合体的结果。该结果可知= PLys嵌段的聚合度越大，高分子微囊复合体的芯部分的大小越 小，会由棒状向球体状接近。
[0134] (7)芯部分的表面积的计算及PEG的平均密度σ的计算
[0135] 将各高分子微囊复合体的芯部分的表面积[An]作为以TEM图像中的长轴[Ln]为旋 转轴、且以短轴的一半长度[r n]为半径的圆柱而按照下述式求得。对TEM图像中的多个芯部 分进行测定，算出平均值。
[0136] 芯部分的表面积：[An] = (Ln X 2πΓη)+2 X (π X rn2)
[0137] 接着，将由上述（5)求得的每1分子高分子微囊复合体中所含的荧光标记PEG - PLys的平均分子数(链)除以高分子微囊复合体的芯部分的平均表面积，由此求得内包核酸 的高分子微囊复合体的芯部分的每单位表面积的嵌段共聚物的平均密度σ(链/nm 2)。
[0138] 该结果为:就内包核酸的高分子微囊复合体的芯部分的每单位表面积的嵌段共聚 物的平均密度σ而言，包含PLys嵌段的聚合度为19的荧光标记PEG-PLys的高分子微囊复合 体为0.075链/nm 2，包含PLys嵌段的聚合度为39的荧光标记PEG-PLys的高分子微囊复合体 为0.051链/nm2,包含PLys嵌段的聚合度为70的荧光标记PEG - PLys的高分子微囊复合体为 0.038链/nm2。即可知存在以下倾向：构成内包核酸的高分子微囊复合体的嵌段共聚物的阳 离子性高分子链嵌段的聚合度越大，芯部分的每单位表面积的嵌段共聚物的平均密度σ越 小。
[0139] (8)血中滞留性的评价
[0140] 对小鼠施予使用经荧光标记的DNA所形成的高分子微囊复合体，利用活体实时共 聚焦扫描显微镜经时性地观察血中滞留时间。全部的图像及动画通过直立显微镜ECLIPSE FNl(尼康公司制）（物镜:20倍、二极管激光:640nm、发射带通滤光片（emission band pass filter) :700/75nm)所附属的共聚焦激光扫描显微镜系统AlR(尼康公司制)取得。
[0141] 具体而言，首先，对8周龄的雌BALB/c小鼠 （Charles River Laboratories公司 制），使用小动物用异氟烧（isoflurane)麻醉器（型式:400、Univentor公司制），通过2.0~ 3.0 %异氟烷(ABBOTT JAPAN公司制)施加麻醉。在这些小鼠的侧面尾静脉，与30号的注射针 (Becton Dickinson公司制)一起插入连接于无毒性的医疗用聚乙稀管(夏目制作所制）的 导管。将施予麻醉的小鼠置于装入显微镜载物台的温度控制垫(制品名:THERMOPLATE (注册 商标）、东海Hit公司制），测定中维持镇静状态。接着，自视频录影开始起10秒后，将内包经 荧光标记的PDNA的高分子微囊复合体(注入量:200yL、DNA浓度：100ng/yL)从尾静脉注入小 鼠中。将耳垂的皮肤与1滴的液浸油一起固定于盖夹(cover clip)之下，并在无外科处置下 进行观察。数据以视频模式下每5分钟的快照（slap shot)的形式取得。该实验就各高分子 微囊复合体对各小鼠分别进行4次。
[0142] 视频数据针对血管内或血管以外的皮肤组织选择有兴趣的区域进行分析。首先， 基于自视频录影开始起10秒钟之间（高分子微囊复合体注入前)取得的视频来确定背景的 荧光强度，使用图像统合软件NIS - Elements C(尼康公司制）来确定各时点的每单位像素 的平均荧光强度。为了获得各时点的经背景补正的强度，从在高分子微囊复合体注入后所 测定的每单位像素的平均强度减去背景值。高分子微囊复合体的体内循环通过由减去来自 组织背景的荧光的血管的荧光强度来进行监测。
[0143] 将小鼠的耳静脉的荧光强度的经时性变化的测定结果示于图2中。从实验开始至 经过40分钟后，就血管的荧光强度而言，在施予包含PLys嵌段的聚合度为19的PEG-PLys的 高分子微囊复合体的情况下（图中，"PLysl9"）最高，在施予包含PLys嵌段的聚合度为70的 PEG - PLys的高分子微囊复合体的情况下（图中，"PLys70"）最低。即可知存在以下倾向：构 成内包核酸的高分子微囊复合体的嵌段共聚物的阳离子性高分子链嵌段的聚合度越小，换 言之，构成内包核酸的高分子微囊复合体的嵌段共聚物的密度越大，则血中滞留性越好。
[0144] [实施例1]
[0145] 针对利用直接内包pDNA的以往方法制造的内包核酸的高分子微囊复合体和利用 以使PDNA的双螺旋结构解离的状态与嵌段共聚物结合的方法制造的内包核酸的高分子微 囊复合体，比较了形状、大小、嵌段共聚物的密度。
[0146] (I) PEG-PAsp (DET) -Chole
[0147] 使用α-甲氧基一ω-氨基PEG(PEG、Mw=12kDa、Mw/Mn=1.05)作为引发剂，并使 β-苄基一L一天冬氨酸酯(BLA)的NCA进行开环聚合，由此制造 PEG嵌段一聚(β-苄基一L一 天冬氨酸酯）嵌段(PEG - PBLA)。此时，通过调节引发剂与单体NCA之比，从而制造聚合度不 同的 3种PEG-PBLA。
[0148] 在10倍当量的二环己基碳二酰亚胺与2倍当量的4 一二甲基氨基吡啶的存在下，使 所得的PEG - PBLA的末端的氨基与具有经活化的羧基的胆固醇衍生物在N，N-二甲基甲酰 胺中反应一夜，所述具有经活化的羧基的胆固醇衍生物是将胆固醇的3-羟基置换为伯氨 基后与琥珀酸酐反应而得到的。将所得的嵌段共聚物滴加到冷二乙基醚与异丙醇的混合溶 剂（2:1(体积比））中进行再沉淀，重复3次该操作后，从苯加以冷冻干燥，由此得到TOG - PBLA-Cho I e的精制粉末。
[0149] 从所得的PEG-PBLA-Cho I e，利用酯一酰胺交换反应在PBLA的侧链中引入二亚乙 基三胺，由此得到PEG-PAsp (DET) - Cho I e。
[0150] 【化5】
[0151]
[0152] (2)荧光标记 PEG-PAsp(DET) - Chole
[0153] 为了确认PEG -PAsp(DET) - Chole与DNA结合，与参考例1的（1)同样地使用Alexa Fluor (注册商标）680 carboxylic acid succinimidyl ester (Molecular Probes 公司 制），预先对PEG-PAsp(DET) - Chole进行荧光标记。通过具备UV检测器、IR检测器及荧光检 测器的GPC来确认PEG-PAsp(DET) - Chole实际被荧光标记的情况。计算荧光标记效率的结 果为:在大致全部的PEG-PAsp(DET) - Chole中每个PAsp(DET)嵌段结合0.3~0.5分子的荧 光物质。
[0154] (3)直接内包pDNA的内包核酸的高分子微囊复合体的形成
[0155] 在PEG - PAsp(DET) - Chole溶液中以使N/P比为4的方式快速混合参考例1中使用 的质粒PBR322溶液，由此形成内包pDNA的PEG-PAsp(DET) - Chole的高分子微囊复合体（以 下，为"ΡΜ- Γ (PM:Polyplex Micelle))。反应溶剂为IOmM HEPES缓冲液(pH7.3)，反应溶液 中的pDNA浓度为33 · 3ng/yL。
[0156] (4)使pDNA变性而内包的内包核酸的高分子微囊复合体的形成
[0157] 在质粒pCAG - Luc(6.4kbp)溶液中添加限制酶而进行限制酶处理，将pCAG-Luc的 1个部位消化为线状。将包含该线状DNA的DNA溶液在95°C加热处理10分钟，使线状化的 pCAG - Luc变性为单链。接着，在经变性的状态的DNA溶液中以使N/P比成为4的方式快速混 合PEG - PAsp(DET) - Chole溶液，由此形成内包来自1分子pCAG - Luc的2条线状单链DNA的 PEG - PAsp(DET) - Chole的高分子微囊复合体（以下，为 "MCPM-l"（MCPM:MeIt Crumpled Polyplex Micel Ie))。溶剂为IOmM HEPES缓冲液（pH7.3)，反应溶液中的pDNA浓度为 33.3ng/yL。予以说明，pCAG - Luc是在质粒pCAGGS(由理研基因库提供）中重组从质粒pGL3 (Promega公司制)切出编码Luc的基因的质粒。
[0158] (5)形成内包核酸的高分子微囊复合体的PEG-PAsp(DET) - Chole的确定
[0159]在上述(3)及(4)中所得的高分子微囊复合体中，为了对使用荧光标记PEG - PAsp (DET) - Chole所形成的高分子微囊复合体测定与DNA结合的荧光标记PEG - PAsp(DET) - Chole量，与参考例1的（5)同样地，对形成高分子微囊复合体后的反应溶液进行超离心分离 处理，基于上清液在702nm下的荧光强度，算出与1分子的pDNA结合的荧光标记PEG - PAsp (DET) - Chole的平均分子数（即，每1分子高分子微囊复合体中所含的荧光标记PEG - PAsp (DET) -Chole的平均分子数、单位:链）。将计算结果示于表1的"结合PEG数(链)"中。
[0160] (6)TEM 观察
[0161] 在上述(3)及(4)中所得的高分子微囊复合体中，对使用未进行荧光标记的PEG - PAsp (DET) -Cho Ie所形成的高分子微囊复合体，与参考例1的（6)同样地，拍摄TEM图像，并 对TEM图像中的高分子微囊复合体的芯部分测定了长轴的长度[Ln]和短轴的长度[2rn]。此 时，在芯部分的形状为圆的情况下，长轴的长度[Ln]成为直径，并与短轴的长度[2rn]相等。 图3中示出两高分子微囊复合体的TEM图像，图4中示出由TEM图像算出的高分子微囊复合体 的长轴的分布。就TEM图像中的高分子微囊复合体的芯部分而言，PM - 1与参考例1同样为棒 状，但MCPM - 1为球体状(平均半径:23 · 1 ± 3 · 8nm) 〇
[0162] (7)芯部分的表面积的计算及PEG的平均密度σ的计算
[0163] 与参考例1的（7)同样地算出TEM图像中的多个PM - 1的芯部分的表面积[An]，并算 出其平均值。
[0164] MCPM-1的芯部分的表面积[An]作为以TEM图像中的长轴[Ln]的一半长度[r n]为半 径的球而按照下述式求得。对TEM图像中的多个芯部分进行测定，算出平均值。
[0165] 芯部分的表面积：[Αη]=4πι·η2
[0166] 接着，由上述（5)中求得的每1分子高分子微囊复合体中所含的荧光标记PEG - PAsp(DET) -Chole的平均分子数(链)除以高分子微囊复合体的芯部分的平均表面积，由此 求得内包核酸的高分子微囊复合体的芯部分的每单位表面积的嵌段共聚物的平均密度σ (链/nm2)。将芯部分的表面积的平均值和芯部分的每单位表面积的嵌段共聚物的平均密度 σ的计算结果分别示为表1的"芯部分的表面积(nm2)"及"PEG密度σ(链/nm2)"。
[0169] 该结果为:尽管内包相同大小的DNA，但是利用以往方法制造的PM - 1是长轴为100 ~150nm的棒状、PEG密度也不足0.1链/nm2，与此相对，使DNA的双螺旋结构解离而形成高分 子微囊复合体的MCPM - 1的芯部分为半径23nm程度的球体状而非常小，而且PEG密度为0.3 链/nm2以上而特别高。即可知：使DNA的双螺旋结构解离而形成高分子微囊复合体，从而可 以形成芯部分的每单位表面积的嵌段共聚物的平均密度大、且球体状
文档序号 :
【 9692029 】
技术研发人员：片冈一则,长田健介,赛奥弗里斯·阿格里斯·由佳利
技术所有人：国立研究开发法人科学技术振兴机构
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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