内包核酸的高分子微囊复合体及其制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及内包核酸(DNA)的高分子微囊复合体。更详细而言,涉及内包较长链的 DNA但充分小的高分子微囊复合体。
[0002] 本申请基于2013年8月6日在日本申请的日本特愿2013 -163106号主张优先权,并 将其内容援引于此。
【背景技术】
[0003 ]作为次世代的治疗法,通过控制基因表达来治疗疾病的基因治疗被寄予极大的期 待。基因治疗中的最大课题在于将基因导入靶标细胞或组织时的导入效率不充分这一点。 尤其,为了实现基于全身施予的基因治疗,需要使基因在血中稳定地循环而集聚到靶标组 织、并在侵入靶标细胞后有效地进行基因表达。因此,为了解决这些问题,盛行的是开发向 靶标细胞等的导入效率、在靶标细胞内的基因表达效率更优选的基因转运体(基因载体)。
[0004] 例如,已知一次结构得到精密控制的高分子会自发产生组织化,可以形成微囊、泡 囊等高次结构体,以往在以药物送达系统、材料科学为首的各种领域中研究了此种高分子 的自组织化的结构体的利用。例如专利文献1中公开了一种静电耦合型高分子微囊药剂载 体,其包含具有非电荷性链段(非电荷性高分子链嵌段)和电荷性链段(电荷性高分子链嵌 段)的嵌段共聚物、且在芯部分可以内包具有与该电荷性链段相反的电荷的药剂。通过使用 阳离子性链段作为上述电荷性链段,从而可以将DNA内包于芯部分。
[0005] 另外,还报告了各种实现更高分子微囊的稳定化的做法。例如,在专利文献2中公 开了一种静电耦合型高分子微囊药剂载体,其通过借助交联剂使嵌段共聚物彼此交联来使 其稳定化。进而,在专利文献3中还公开了含有非电荷性亲水性高分子链嵌段和在侧链的一 部分导入了疏水性基的阳离子性聚氨基酸链嵌段的嵌段共聚物。该嵌段共聚物通过在侧链 导入疏水性基,从而使表面能增大,因此微囊内的凝聚力增强,芯变小,结果实现了高分子 微囊的稳定化。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1:日本特开平8 -188541号公报 [0009] 专利文献2:国际公开第2004/105799号 [0010] 专利文献3:国际公开第2009/113645号
【发明内容】
[0011] 发明要解决的课题
[0012] 在全身施予基因载体的情况下,为了在靶标细胞中导入基因,需要使基因载体的 血中滞留性较高。
[0013] 另外,若基因载体的大小过大,则存在难以摄入细胞的问题。尤其对于像胰脏癌那 样血管密度低的癌症,血管的透过性成为障壁,通过全身施予而使尺寸IOOnm的基因载体送 达癌组织深部是非常困难的。
[0014] 在静电耦合型高分子微囊药剂载体的芯收容了基因的高分子微囊复合体非常有 望成为基因载体,但是在大小、血中滞留性的方面还尚有改善的余地。
[0015] 本发明的主要目的在于提供内包较长链的DNA、大小充分小、还可以作为基因载体 发挥功能的高分子微囊复合体以及其制造方法。
[0016] 用于解决课题的手段
[0017] 本发明人等对在包含生物适合性中性高分子即聚乙二醇(PEG)和阳离子性高分子 (以下,有时简写成"阳离子性高分子链嵌段"。)的嵌段共聚物中内包有作为环状双链DNA的 质粒DNA(以下,有时简写成"pDNA"。)的高分子微囊复合体调查了阳离子性高分子链嵌段的 长度(聚合度)与高分子微囊复合体的粒径的关系,结果发现:在阳离子性高分子链嵌段的 长度较短的情况下,高分子微囊复合体是长轴为IOOnm以上的棒状,但是阳离子性高分子链 嵌段的长度越长,则长轴的长度越短,在阳离子性高分子链嵌段的长度充分长时,存在减小 至接近球体状的形状的倾向。另外,对PEG密度与血中滞留时间的关系进行了调查,结果发 现:越是PEG密度高的高分子微囊复合体,存在血中滞留时间越长的倾向。在此,若阳离子性 高分子链嵌段的长度变长,则与1分子的PDNA结合的嵌段共聚物数变少,结果导致PEG密度 降低。即,可知:在内包pDNA的高分子微囊复合体的情况下,若为了减小粒径而使PEG密度降 低,则血中滞留性降低。
[0018] 本发明人等进行了进一步研究,结果发现通过在使PDNA的双螺旋结构解离的状态 下与嵌段共聚物混合而形成复合体,从而可以在不降低构成壳部分的非电荷性亲水性高分 子链嵌段的密度的情况下形成远比棒状更小的球体状的高分子微囊复合体,以至完成本发 明。
[0019] 即,本发明的内包核酸的高分子微囊复合体及其制造方法为下述[1]~[15]。
[0020] [1]-种内包核酸的高分子微囊复合体,其特征在于,其由含有非电荷性亲水性高 分子链嵌段及阳离子性高分子链嵌段的嵌段共聚物、与包含1000个碱基长度以上的彼此互 补的碱基序列的2条单链DNA、至少双螺旋结构的一部分解离为单链结构的1000个碱基对长 度以上的双链DNA、或1000个碱基长度以上的1条单链DNA形成。
[0021] [2]根据上述[1]的内包核酸的高分子微囊复合体,其由含有非电荷性亲水性高分 子链嵌段及阳离子性高分子链嵌段的嵌段共聚物、与包含1000个碱基长度以上的彼此互补 的碱基序列的2条单链DNA、或至少双螺旋结构的一部分解离为单链结构的1000个碱基对长 度以上的双链DNA形成。
[0022] [3]根据上述[1]或[2]的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,上述单链DNA为 2000个碱基长度以上,上述双链DNA为2000个碱基对长度以上。
[0023] [4]根据上述[1]~[3]中任一项的内包核酸的高分子微囊复合体,其在水性介质 中的采用动态光散射法的平均粒径为IOOnm以下。
[0024] [5]根据上述[1]~[4]中任一项的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,DNA和利 用静电相互作用与DNA结合的阳离子性高分子链嵌段形成芯部分,非电荷性亲水性高分子 链嵌段形成壳部分。
[0025] [6]根据上述[5]的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,上述芯部分的平均粒径 为50nm以下。
[0026] [7]根据上述[1]~[6]中任一项的内包核酸的高分子微囊复合体,其为球体状。
[0027] [8]根据上述[1]~[7]中任一项的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,上述单链 DNA或上述双链DNA为线状。
[0028] [9]根据上述[1]~[8]中任一项的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,上述嵌段 共聚物的至少一部分彼此交联。
[0029] [10]根据上述[1]~[9]中任一项的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,在上述 阳离子性高分子链嵌段的主链或侧链以共价键结合有疏水性基。
[0030] [11]根据上述[1]~[10]中任一项的内包核酸的高分子微囊复合体,其中,在上述 阳离子性高分子链嵌段的侧链具有乙胺结构或丙胺结构。
[0031 ] [ 12] -种内包核酸的高分子微囊复合体的制造方法,其特征在于,其是制造收容 有DNA的内包核酸的高分子微囊复合体的方法,
[0032] 该方法具有如下工序:将含有非电荷性亲水性高分子链嵌段及阳离子性高分子链 嵌段的嵌段共聚物、与使双螺旋结构的至少一部分解离的状态的1000个碱基对长度以上的 双链DNA在水性介质中混合。
[0033] [ 13]根据[12]的内包核酸的高分子微囊复合体的制造方法,其中,上述双链DNA为 2000个碱基对长度以上。
[0034] [14]根据上述[12]或[13]的内包核酸的高分子微囊复合体的制造方法,其中,上 述双链DNA为线状。
[0035] [15]根据[12]~[14]中任一项的内包核酸的高分子微囊复合体的制造方法,其 中,上述双链DNA为在60°C以上变性后的双链DNA。
[0036]发明效果
[0037]根据本发明,即使使用在将1000个碱基对长度以上、优选2000个碱基对长度以上 的长链的DNA收容于内部时以往主要形成棒状或环状的内包核酸的高分子微囊复合体的嵌 段共聚物的情况下,也能够提供球体状的高分子微囊复合体。球体状的高分子微囊复合体 的粒径比棒状的内包核酸的高分子微囊复合体更小,且构成该嵌段共聚物的非电荷性亲水 性高分子链嵌段的密度也较大,因此向细胞中的摄入效率和血中滞留性这两者均优异。
【附图说明】
[0038] 图1为表示在参考例1中各高分子微囊复合体的TEM图像和由该图像算出的高分子 微囊复合体(棒状粒子)的长轴长的分布的图。
[0039] 图2为表示在参考例1中全身施予各高分子微囊复合体后的小鼠的耳静脉的荧光 强度经时变化的测定结果的图。
[0040] 图3为实施例1中使用荧光标记PEG-PAsp(DET) - Chole所形成的高分子微囊复合 体(左:PM - 1、右:MCPM - 1)的 TEM图像。
[0041] 图4为表示实施例1中由TEM图像算出的高分子微囊复合体的长轴长的分布的图 (左:PM-1、右:MCPM-1)。
[0042] 图5为实施例2中全身施予高分子微囊复合体MCPM-2 - GFP的小鼠的胰脏癌组织 的荧光图像。
[0043]图6为实施例2中全身施予高分子微囊复合体PM- 2-GFP的小鼠的胰脏癌组织的 荧光图像。
[0044]图7为实施例2中全身施予高分子微囊复合体MCPM- 1的小鼠的胰脏癌组织的荧光 图像。
[0045]图8为表示实施例2中对施予收容GFP基因的高分子微囊复合体中的PM- 2-GFP的 胰脏癌模型小鼠和施予了其中的MCPM-2-GFP的胰脏癌模型小鼠的胰脏癌组织深部的GFP 表达的相对荧光强度的测定结果的图。
[0046]图9为表示在实施例3中相对于全身施予于小鼠的高分子微囊复合体的总量的、全 身施予后经过30分钟后在血中滞留的高分子微囊复合体量的比例(% )的测定结果的图。 [0047]图10为实施例4中全身施予了高分子微囊复合体(MCPM-4 -Venus -CL)的小鼠的 胰脏癌组织的荧光图像。
[0048]图11为表示实施例5中各高分子微囊复合体的TEM图像的图。
[0049] 图12为表示实施例6中各高分子微囊复合体的TEM图像的图。
[0050] 图13为表示实施例6中由各高分子微囊复合体的TEM图像算出的高分子微囊复合 体的长轴长的分布的图。
[0051 ]图14为表示实施例7中以各温度进行变性处理后的高分子微囊复合体的长轴长及 纵横比的分布的图。
[0052]图15为表示在实施例8中转染了收容荧光素酶基因的PEG - PLys、或PEG - PLys - PDP的细胞株的荧光素酶表达的相对荧光强度的测定结果的图。
[0053] 图16为表示实施例9中对全身施予各高分子微囊复合体的小鼠测定胰脏癌的大小 的结果的图。
【具体实施方式】
[0054] 本发明的内包核酸的高分子微囊复合体由含有非电荷性亲水性高分子链嵌段及 阳离子性高分子链嵌段的嵌段共聚物和核酸(DNA)形成,结合有上述阳离子性高分子链嵌 段的核酸形成芯部分,上述非电荷性亲水性高分子链嵌段形成壳部分。以下进行详细说明。 [0055] <非电荷性亲水性高分子链嵌段>
[0056] 本发明中所使用的嵌段共聚物含有非电荷性亲水性高分子链嵌段和阳离子性高 分子链嵌段。作为非电荷性亲水性高分子链嵌段,例如可例示来自PEG、聚丙二醇等聚亚烷 基二醇;聚(2 -甲基一 2 -噁唑啉)、聚(2 -乙基一 2 -噁唑啉)、聚(2-异丙基一 2-噁唑啉) 等聚噁唑啉;多糖、葡聚糖(dextran)、聚乙稀醇、聚乙烯基吡略烧酮、聚丙稀酰胺、聚甲基丙 烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯及它们的衍生物的各种嵌段等。其中,从作为生物适 合性高的中性的水溶性高分子的方面出发,优选PEG、聚噁唑啉、葡聚糖、聚乙烯醇。
[0057] 非电荷性亲水性高分子链嵌段的分子量只要能够使嵌段共聚物形成内部收容有 核酸的高分子微囊复合体的大小即可,并无特别限定。
[0058]例如,在使用来自PEG的嵌段(聚氧乙烯链嵌段、以下,有时简称为"PEG嵌段"。)作 为非电荷性亲水性高分子链嵌段的情况下,PEG嵌段的分子量优选为约1.0~lOOkDa、更优 选为2~80kDa、进一步优选为8~25kDa。另外,作为PEG嵌段中的氧乙稀的重复单元数,优选 22~2300个、更优选45~1850个、进一步优选180~600个。
[0059] <阳离子性高分子链嵌段>
[0060] 作为本发明中所使用的阳离子性高分子链嵌段,只要是包含能够与DNA静电结合 的阳离子性的高分子链的嵌段即可,并无特别限定。具体而言,例如可列举:在侧链具有阳 离子性基的聚氨基酸衍生物;聚乙撑亚胺(PEI);聚甲基丙烯酸衍生物、聚丙烯酸衍生物等 丙稀酸系树脂等。
[0061] 作为本发明中所使用的阳离子性高分子链嵌段,优选使用来自阳离子性氨基酸的 聚氨基酸或其衍生物的嵌段、来自在阴离子性氨基酸的阴离子性基(通常为羧基)上通过酯 键或酰胺键等结合有阳离子性化合物的氨基酸衍生物的嵌段。作为阳离子性氨基酸的聚氨 基酸,可列举聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚高精氨酸及聚组氨酸等。另外,作为使阴离 子性氨基酸上结合有阳离子性化合物的氨基酸衍生物,可列举天冬氨酸或谷氨酸的1个羧 基与除了跟羧基结合的部位以外还具有氨基、亚氨基、季氨基等阳离子性基的化合物结合 的衍生物。作为具有该阳离子性基的化合物,例如可列举各种二胺等。具有来自使天冬氨酸 或谷氨酸的1个羧基与二亚乙基三胺反应而得的氨基酸衍生物的重复单元的嵌段在侧链具 有乙胺结构。此外,还优选具有来自在侧链导入了丙胺结构的聚氨基酸衍生物的重复单元 的嵌段。
[0062] 本发明中,特别优选使用将来自以赖氨酸和/或其衍生物作为重复单元的聚氨基 酸的嵌段(以下,有时称作"PLys嵌段"。)、或来自以使天冬氨酸的1个羧基与二亚乙基三胺 结合而成的氨基酸衍生物和/或其衍生物作为重复单元的聚氨基酸的嵌段(以下,有时称作 "PAsp(DET)嵌段"。)作为阳离子性高分子链嵌段的嵌段共聚合。
[0063] 作为阳离子性高分子链嵌段中的重复单元数,为了在嵌段共聚物形成内部收容了 核酸的高分子微囊复合体时容易使形成壳的非电荷性亲水性高分子链嵌段的密度充分提 高,优选10~200个,更优选20~100个。
[0064] 通过在阳离子性高分子链嵌段的侧链或其末端(与以共价键直接或间接键合于非 电荷性亲水性高分子链嵌段的末端相反一侧的末端)以共价键结合疏水性基,从而可以使 所得内包核酸的高分子微囊复合体更稳定化。当在阳离子性高分子链嵌段的侧链具有疏水 性基的情况下,疏水性基可以以任意方式配置于阳离子性高分子链嵌段中,例如可列举无 规配置的情况、以嵌段的形式配置的情况(即,由非电荷性亲水性高分子链嵌段、包含在侧 链以共价键结合有疏水基的重复单元的阳离子性高分子链嵌段、和包含不担载疏水基的重 复单元的阳离子性高分子链嵌段形成三嵌段的情况)。
[0065] 作为疏水性基,可列举固醇衍生物的残基或C4-24烃基。固醇是指以环戊酮氢菲环 (C17H28)为基体的天然、半合成或合成的化合物,例如,作为天然的固醇,并不受限定,但是 可列举胆固醇、胆
文档序号 :
【 9692029 】
技术研发人员:片冈一则,长田健介,赛奥弗里斯·阿格里斯·由佳利
技术所有人:国立研究开发法人科学技术振兴机构
备 注:该技术已申请专利,仅供学习研究,如用于商业用途,请联系技术所有人。
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