内包核酸的高分子微囊复合体及其制造方法
[0094] 作为通式（I)及（II)所示的嵌段共聚物的、更具体的制造方法，例如可优选列举： 使用在末端具有氨基的PEG嵌段衍生物，并在该氨基末端聚合β-苄基一 L 一天冬氨酸酯 (BLA)及Νε -Z - L一赖氨酸等保护氨基酸的N-羧酸酐(NCA)而合成嵌段共聚物，之后，以使 各嵌段的侧链成为具有上述阳离子性基的侧链的方式用二亚乙基三胺(DET)等进行置换或 变换的方法。
[0095] 本发明中，作为通式（I)及（II)所示的嵌段共聚物的具体例，例如可优选列举:后 述的实施例中记载的PEG-聚[Ν-[Ν'-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基）]天冬酰胺](PEG - PAsp (DET))、PEG-聚赖氨酸(PEG - PLys)、以及在这些阳离子性嵌段的主链末端直接或根据需 要借助连结基附加固醇衍生物的残基的嵌段共聚物、在这些阳离子性嵌段的侧链附加硫醇 基的嵌段共聚物等。
[0096] <嵌段共聚物的修饰>
[0097]在将高分子微囊复合体用作基因载体时，为了将基因（DNA)有效地搬运至靶标组 织、靶标细胞，而优选使表面具有与特定的细胞或组织的亲和性高的分子(靶标指向性分 子）。例如，在非电荷性亲水性高分子链嵌段的2个末端中，在与以共价键直接或间接地结合 于阳离子性高分子链嵌段的末端相反一侧的末端，直接或借助适当的连接子附加靶标指向 性分子，由此可以形成在表面露出了靶标指向性分子的内包核酸的高分子微囊复合体。作 为靶标指向性分子，例如可列举针对特定的受体蛋白等的配位体或抗体(其片段:F(ab'）2、 F(ab)等）、糖、核定位信号分子(nuclear localization signal molecule)等。本发明的内 包核酸的高分子微囊复合体尽管在内部收容2000个碱基对长度以上的长度的DNA，但是仍 是以往所没有的小粒子。因此，通过在其表层具有核定位信号分子，从而即使对非分裂细胞 也可以成功地经由通过核膜孔而导入基因。
[0098] <内包核酸的高分子微囊复合体>
[0099]本发明的内包核酸的高分子微囊复合体所内包的核酸为包含2000个碱基长度以 上的彼此互补的碱基序列的2条单链DNA、或2000个碱基长度以上的1条单链DNA。就包含彼 此互补的碱基序列的2条单链DNA而言，通常彼此结合的双链DNA采取双螺旋结构。双螺旋结 构刚性非常强，因此在通过仅将双链DNA和嵌段共聚物混合并利用自组织化形成内包DNA的 高分子微囊复合体的以往方法形成内包核酸的高分子微囊复合体的情况下，只要不使壳部 分的非电荷性亲水性高分子链嵌段的密度充分降低，则无法形成接近球体状的小粒子。
[0100] 对此，本发明的内包核酸的高分子微囊复合体内包包含1000个碱基长度以上(优 选1500碱基长以上、更优选2000个碱基长度以上）的彼此互补的碱基序列的2条单链DNA、至 少双螺旋结构的一部分解离为单链结构的1000个碱基对长度以上（优选1500碱基对长以 上、更优选2000个碱基对长度以上）的双链DNA、或1000个碱基长度以上(优选1500碱基长以 上、更优选2000个碱基长度以上）的1条单链DNA作为芯部分。即，在本发明的内包核酸的高 分子微囊复合体内包PDNA等2条链DNA的情况下，1000个碱基对长度以上(优选1500碱基对 长以上、更优选2000个碱基对长度以上）的双链DNA以使双螺旋结构至少一部分解离、优选 全部解离的状态与上述嵌段共聚物中的阳离子性高分子链嵌段静电耦合而被收容。因单链 DNA表现为挠性链(flexible chain)，因此在与上述嵌段共聚物静电耦合时，能够凝缩转移 成球体状。即，可以使芯部分(DNA)的表面积非常小，由此壳部分的非电荷性未水性尚分子 链嵌段的密度也会飞跃性地增大。
[0101] 本发明的内包核酸的高分子微囊复合体可以通过如下方式获得:在使双链DNA的 双螺旋结构的全部或至少一部分解离的状态下，与嵌段共聚物混合，并使其自组织化，由此 形成以DNA作为芯的高分子微囊复合体。为了使DNA凝缩得最小而得到球体状的芯，优选使 内包的双链DNA以完全解离的2条单链DNA的状态与嵌段共聚物混合，并使其自组织化。由 此，形成在芯中包含2条单链DNA的内包核酸的高分子微囊复合体、或者在芯中包含1条单链 DNA的内包核酸的高分子微囊复合体。予以说明，双链DNA的双螺旋结构向单链结构的解离 可以通过由利用加热处理的变性(热变性)所致的变性等以往公知的变性方法来适当进行。 加热处理的温度只要为室温以上即可，优选60°C以上、更优选70°C以上、进一步优选80°C以 上、特别优选95°C以上。通过以上述温度以上进行加热处理，从而可以使1000个碱基对长度 以上的双链DNA的双螺旋结构适当地解离。双链DNA的双螺旋结构的解离的程度可以通过调 查熔解曲线来进行判别。
[0102] 本发明中，嵌段共聚物中内包的DNA只要是在与嵌段共聚物的混合时使双螺旋结 构至少一部、优选全部解离的状态即可，可以为环状DNA。本发明中，为了使双螺旋结构更容 易解离，优选的是线状DNA。环状DNA通过预先利用限制酶处理等使其线状化，从而可以更容 易使双螺旋结构解离。
[0103 ]本发明的内包核酸的高分子微囊复合体除了以使内包的双链DNA变性(单链化)的 状态与嵌段共聚物混合以外，可以与专利文献1~3等中所公开的形成内包核酸的高分子微 囊复合体的方法等同样地形成。例如，作为成为将变性的DNA与嵌段共聚物混合的反应溶剂 的水性介质，为水(尤其是去离子水)或在水中包含各种无机缓冲剂或有机缓冲剂的水性介 质，可以在对本发明的复合体的形成反应不带来不良影响的范围内包含乙腈、二甲基甲酰 胺、乙醇等与水共混的有机溶剂。制备的内包核酸的高分子微囊复合体的分离及精制可以 利用常规方法从水性介质中回收。作为典型的方法，可列举超滤法、渗滤(diaf i I tration)、 透析方法。
[0104]另外，当使用在阳离子性高分子链嵌段中具有硫醇基的嵌段共聚物的情况下，形 成内包DNA的高分子微囊复合体后，将含有该高分子微囊复合体的水性介质放置于氧化条 件下，由此可以将阳离子性高分子链嵌段彼此利用基于硫醇基的SS键进行交联。通常，就氧 化条件而言，在周围环境下放置或在空气氧化的条件下放置为佳。交联的程度并无特别限 定，但优选在形成高分子微囊复合体的阳离子性高分子链嵌段中导入5~20%、优选8~ 15 %的SH基、并使所有的硫醇基氧化的程度。
[0105] 本发明的内包核酸的高分子微囊复合体利用动态光散射法测定的水性介质中的 平均粒径优选为IOOnm以下、更优选为80nm以下、进一步优选为70nm以下。本发明的内包核 酸的高分子微囊复合体如上述那样非常小，因此可有效地进入靶标细胞或组织中。予以说 明，内包核酸的高分子微囊复合体在水性介质中的粒径例如可以使用采用了非接触后方散 射光学系(NIBS)的动态光散射式粒径?粒度分布测定装置来测定。作为该装置，例如可列 举Zetasizer Nano ZS(制品名）(Malvern公司制）。另外，内包核酸的高分子微囊复合体在 水性介质中的平均粒径是指利用动态光散射法测定的水性介质中的zeta平均流体力学粒 径。
[0106] 本发明的内包核酸的高分子微囊复合体可以利用透射型电子显微镜(TEM)来观察 芯部分(DNA)。本发明的内包核酸的高分子微囊复合体的芯部分为球体状而不为棒状。若实 际上用TEM观察本发明的内包核酸的高分子微囊复合体，则观察到圆状而非棒状的芯部分。 在本发明及本申请说明书中，"球体状"不仅包括真正的球状，而且还包括接近球的椭球体 状(例如，三径中的最长径与剩余一方的径之比为2:1~1:1的椭球体状）。就本发明的内包 核酸的高分子微囊复合体而言，通过使芯部分为球体状，从而可比芯部分为棒状的内包核 酸的高分子微囊复合体提高芯部分的单位表面积的嵌段共聚物的平均密度。本发明的内包 核酸的高分子微囊复合体中，越是提高芯部分的单位表面积的嵌段共聚物的平均密度，越 难以受到多数存在于生体内的细胞内外的聚阴离子的影响，可提高生体内稳定性。
[0107] 另外，作为本发明的内包核酸的高分子微囊复合体的大小，芯部分的平均粒径优 选为50nm以下、更优选为40nm以下、进一步优选为30nm以下、更进一步优选为25nm以下。予 以说明，在本发明及本申请说明书中，"内包核酸的高分子微囊复合体的芯部分"是指在利 用TEM拍摄内包核酸的高分子微囊复合体时被拍摄到的部分，"芯部分的粒径"是指球体状 的半径（即，在TEM图像中所拍摄到的芯部分的圆状的半径）。内包核酸的高分子微囊复合体 的芯部分的粒径可以如后述参考例(6)所示那样从TEM图像求得。
[0108] 就本发明的内包核酸的高分子微囊复合体而言，芯部分的单位表面积的嵌段共聚 物的平均密度优选为0.01链/nm2以上、更优选为0.03链/nm 2以上、进一步优选为0.05链/nm2 以上。本发明的内包核酸的高分子微囊复合体能够充分地增大嵌段共聚物密度，因此在对 全身进行施予时能够使血中滞留性良好。
[0109] 予以说明，内包核酸的高分子微囊复合体的芯部分的单位表面积的嵌段共聚物的 平均密度可以利用以下的方法来计算。首先，使用经荧光标记的嵌段共聚物，得到本发明的 内包核酸的高分子微囊复合体。接着，从反应溶剂中离心除去复合体，以荧光强度作为指标 对上清液中所含的不参与复合体形成的嵌段共聚物进行定量。由与复合体制备时所使用的 嵌段共聚物总量的差值算出与复合体结合的嵌段共聚物的分子数，再由该分子数除以反应 中所使用的双链DNA的分子数，由此算出形成1分子内包核酸的高分子微囊复合体的嵌段共 聚物的平均分子数(单位:链）。进而，对所得内包核酸的高分子微囊复合体的TEM图像进行 拍摄，并对所得TEM图像中的多个内包核酸的高分子微囊复合体求得各自的芯部分的圆形 半径的长度，将各内包核酸的高分子微囊复合体的芯部分的表面积作为以TEM图像上的半 径为旋转轴的旋转球来进行计算，算出每1分子内包核酸的高分子微囊复合体的芯部分的 平均表面积(nm2)。最后，由形成1分子内包核酸的高分子微囊复合体的嵌段共聚物的平均 分子数除以每1分子内包核酸的高分子微囊复合体的芯部分的平均表面积，由此求得内包 核酸的高分子微囊复合体的芯部分的单位表面积的嵌段共聚物的平均密度(链/nm 2)。
[0110]实施例 以下，利用实施例等对本发明进行更详细地说明，但是本发明并不受这些例子的 限定。另外，以下的所有动物实验依据与国立大学法人东京大学的实验动物的管理和使用 有关的指南来进行。
[0112] [参考例1]
[0113] 利用包含PEG嵌段和PLys嵌段的嵌段共聚物，调查内包双螺旋结构的双链DNA (PDNA)的高分子微囊复合体中的、PLys嵌段的聚合度与高分子微囊复合体的形状的关系。
[0114] (I)PEG-PLys
[0115] 使用基于由本发明人之一已经公开的方法(Kataoka et al ·，Macromolecules， 1996，νο1·29，ρ·8556 -8557)得到的α -甲氧基一ω -氨基PEG(PEG、Mw=12kDa、Mw/Mn = 1.05)作为引发剂，并使Νε -三氟乙酰基一 L一赖氨酸的N-甲酸酐(NCA)进行开环聚合，由 此制造 PEG嵌段一聚（ε -二氣乙酰基一L -赖氨酸)嵌段(PEG-PLys(TFA))。此时，调节引发 剂与单体NCA之比，由此制造聚合度不同的3种PEG - PLys(TFA)。将如此得到的3种PEG - PLys(TFA)的三氟乙酰基（TFA基）用氢氧化钠进行脱保护，得到聚合度（下述化学式中的 "nl"）不同的 3 种PEG-PLys。
[0118] 各PEG -PLys的PLys嵌段的聚合度基于由1H-NMR测定得到的PEG链（一CH2CH 2O-) 的亚甲基的质子的总量与赖氨酸重复单元[一（CH2) 3CH2NH3)的亚甲基的质子的总量之比各 自求得为19、39、及70。予以说明，凝胶渗透色谱法(GPC)(使用东曹公司制的高效GPC装置 HLC-8220GPC。）的结果:3种PEG-PLys的分散度(Mw/Mn)均不足1.1。
[0119] (2)荧光标记 PEG-PLys
[0120] 为了确认PEG -PLys与DNA结合，而预先将PEG -PLys进行荧光标记。具体而言，依 据制造者的使用说明书，使Alexa Fluor(注册商标）680 carboxylic acid succinimidyl ester (Mo lecular Probes公司制）与上述（I)得到的PEG - PLys反应而结合。将未反应的焚 光物质使用F1D -10脱盐柱(GE Healthcare Life Sciences公司制）来除去。通过具备UV检 测器、IR检测器及荧光检测器的GPC来确认PEG - PLys实际被荧光标记的情况。计算荧光标 记效率的结果为：在大致全部的PEG - PLys中每40个赖氨酸重复单元结合1分子的荧光物 质。
[0121] (3)使用的核酸
[0122] 为了形成用于测定芯部分的每单位表面积的PEG的平均密度σ的内包核酸的高分 子微囊复合体，使用了市售的质粒pBR322(4361bp、TAKARA BIO公司制）。
[0123] 为了形成用于调查血中滞留性的内包核酸的高分子微囊复合体，使用了被荧光物 质〇7(注册商标)5标记过的质粒口046 - 1^^2(6.4此。）<^046 - 1^11〇2的焚光标记使用1^匕61 IT(注册商标)Tracker Nucleic Acid Localization Kit(Mirus Bio公司制）来进行。予以 说明，PCAG - Luc2是在质粒pCAGGS(由理研基因库提供）中重组从质粒pGL4(Promega公司 制)切出编码Luc2的基因的质粒。
[0124] (4)内包核酸的高分子微囊复合体的形成
[0125] 在PEG - PLys溶液中以N/P比为2的方式快速混合DNA溶液，由此形成内包pDNA的 PEG - PLys的高分子微囊复合体。予以说明，N/P比为[PLys嵌段中的胺基的摩尔浓度]/ [pDNA中的磷酸基的摩尔浓度]。反应溶剂为IOmM HEPES缓冲液(pH7.3 )，就反应溶液中的 PDNA浓度而言，在形成用于测定PEG的平均密度(〇)的内包核酸的高分子微囊复合体的情况 下，为33.3ngAxL，在形成用于测定血中滞留性的内包核酸的高分子微囊复合体的情况下， 为lOOng/yL。
[0126] (5)形成内包核酸的高分子微囊复合体的PEG-PLys的确定
[0127] 对于使用荧光标记PEG - PLys所形成的高分子微囊复合体，为了使未结合pDNA的 游离的荧光标记PEG-PLys分离与结合了pDNA的荧光标记PEG-PLys分离，将形成高分子微 囊复合体后的反应溶液加入到厚壁的聚碳酸酯制管（制品编号：343776、Beckman Coulter 公司制）中进行超离心分离处理。关于超离心分离处理，使用具备TLA -120.1转子(B
文档序号 :
【 9692029 】
技术研发人员：片冈一则,长田健介,赛奥弗里斯·阿格里斯·由佳利
技术所有人：国立研究开发法人科学技术振兴机构
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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